新型優(yōu)化多肽pm11對(duì)口腔常見(jiàn)微生物殺菌作用的初步研究.pdf

1、1.背景與目的：
　　齲病是最常見(jiàn)的口腔疾病之一。在美國(guó)有近90％的青少年或年輕成人患有，或者曾患有齲病。食物、病原菌、宿主和時(shí)間為齲病發(fā)生的主要因素。多種細(xì)菌、蛋白等在牙齒表面作用一定時(shí)間形成生物膜。生物膜結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌免受外界刺激的傷害,還能夠增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)一般抗菌藥物的抵抗能力。因此，對(duì)生物膜的控制一直是齲病防治的關(guān)鍵。氟化物的防齲能力是肯定的，但其推廣有一定的限制。傳統(tǒng)抗生素容易誘使細(xì)菌發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性。因此，需要研

2、發(fā)新型的能夠抑制游離或生物膜狀態(tài)微生物的藥物。
　　抗菌肽是近來(lái)口腔微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，抗菌肽因?yàn)榫哂锌咕V廣、無(wú)免疫原性等特點(diǎn)，所以極有可能成為一種高效、低毒的臨床新型藥物。從美洲鰈(Pleuronectes americanus)的表皮中分離出來(lái)的α螺旋陽(yáng)離子抗菌肽pleurocidin，成為近年來(lái)研究較多的抗菌肽之一，具有確定的抗菌效果。但是 pleurocidin的長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸，過(guò)長(zhǎng)的氨基酸更加難以滲透進(jìn)入生物膜內(nèi)部

3、，而且過(guò)長(zhǎng)氨基酸應(yīng)用于臨床上也提高了合成成本，因此我們需要開(kāi)發(fā)新的短肽。本研究在pleurocidin活性中心的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的新型抗菌多肽pm11，并驗(yàn)證其殺菌效果。
　　2.方法：
　　2.1使用二倍稀釋法檢測(cè)pm11對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的MIC（最小抑菌濃度），然后使用平板涂布法檢測(cè)MBC（最小殺菌濃度）。
　　2.2使用檢測(cè)時(shí)間殺死曲線（CLSI M26-A）的方法測(cè)定高濃度pm11對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的抗菌作用。

4、　　2.3通過(guò)軟瓊脂鋪板抑菌圈方法進(jìn)一步直觀檢測(cè)pm11對(duì)口腔常見(jiàn)微生物在唾液環(huán)境下的抗菌作用。
　　2.4培養(yǎng)細(xì)菌生物膜，以PBS處理組為陰性對(duì)照，異丙醇處理組為陽(yáng)性對(duì)照，pm11處理組為實(shí)驗(yàn)組，使用活菌死菌染色劑（LIVE/DEAD? BacLightTM Bacterial Viability Kit L-13152, Invitrogen Inc.美國(guó)）避光染色后，激光共聚焦(CLSM)觀察生物膜。
　　2.5培養(yǎng)細(xì)

5、菌懸液，以PBS處理組為陰性對(duì)照，pm11處理組為實(shí)驗(yàn)組。固定脫水冷凍干燥噴金后使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察pm11的殺菌作用。
　　3.結(jié)果：
　　3.1 pm11對(duì)8種微生物具有抗菌活性，且抗菌活性相差很大,MIC范圍為2-256μg/ml，MBC范圍為4->256μg/ml。
　　3.2短期（2h）殺菌動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示致齲菌隨著pm11作用時(shí)間的增加，存活細(xì)菌數(shù)顯著下降。
　　3.3溶解在唾液和超純水中的

6、pm11的抑菌效果并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而且濃度越大，pm11的殺菌效果越強(qiáng)。
　　3.4 pm11處理組紅色死菌數(shù)量明顯增多，而且死菌的區(qū)域有向團(tuán)聚生物膜內(nèi)細(xì)菌蔓延的趨勢(shì)。
　　3.5 SEM結(jié)果直觀地看到pm11作用下的細(xì)菌細(xì)胞膜表面有明顯的孔洞、細(xì)胞皺縮、細(xì)菌溶脹及細(xì)胞裂解或碎片。
　　4.結(jié)論：
　　4.1 pm11對(duì)懸浮態(tài)細(xì)菌具有不同的殺菌作用并且呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　4.2 pm