神經(jīng)母細(xì)胞瘤側(cè)群細(xì)胞的干細(xì)胞特性鑒定及雌激素和雙酚A對(duì)其作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastonm，NB)是小兒最常見的惡性實(shí)體腫瘤之一，占兒童期腫瘤的8～10％，其惡性程度高，多數(shù)患兒最終愈后不良，故深入研究NB的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理至關(guān)重要。我們課題組在對(duì)NB的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：雌激素(estrogen，E)和環(huán)境雌激素雙酚A(bisphenolA，BPA)均能促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，即E和BPA均可促進(jìn)NB的發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，我

2、們?cè)噲D探尋E和BPA對(duì)NB起始環(huán)節(jié)的作用，而腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcell，CSC)即屬于腫瘤的起源細(xì)胞，故我們選擇研究“E和BPA對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株的CSC的影響”來探尋“E和BPA對(duì)NB起始環(huán)節(jié)有無作用”。
　　研究目的：
　　SP(sidepopulation，SP)分析法從神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞株中分離并鑒定出CSC，明確E和BPA干預(yù)對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株的CSC有無影響，最終了解

3、E和BPA對(duì)NB的起始環(huán)節(jié)有無作用。
　　材料與方法：
　　一、SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的檢測(cè)及檢測(cè)條件的優(yōu)化：不同的Hoechst孵育時(shí)間、不同的維拉帕米濃度檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞(側(cè)群細(xì)胞)比例，根據(jù)SP細(xì)胞的檢測(cè)效果選擇各自的最佳條件；不同濃度Hoechst染色后的表型觀察、CCK-8活細(xì)胞數(shù)評(píng)定了解Hoechst對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株的毒性；不同濃度Hoechst染色后的流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析、Ann

4、exinV-FITC和PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀凋亡及死亡分析、再培養(yǎng)后SP細(xì)胞比例的檢測(cè)，探討Hoechst對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株毒性的機(jī)理；最后對(duì)比不同濃度Hoechst對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞檢測(cè)效果，選擇出能有效檢測(cè)SP細(xì)胞并最低毒性的Hoechst濃度。
　　二、SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的分選及其干細(xì)胞特性的鑒定：流式細(xì)胞儀于SK-N-SH細(xì)胞株中分選出SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞(NSP細(xì)胞)；SP和NSP細(xì)胞均分別接種

5、于正常生長培養(yǎng)基和干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代，觀察細(xì)胞表型的變化；電鏡觀察SP和NSP細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光和免疫印跡法了解SP和NSP細(xì)胞的干細(xì)胞和分化細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)；CCK-8分析了解SP和NSP細(xì)胞的增殖能力；連續(xù)培養(yǎng)的SP和NSP細(xì)胞的表型觀察、蛋白標(biāo)志物表達(dá)及流式細(xì)胞儀SP細(xì)胞比例再檢測(cè)了解各細(xì)胞亞型的分化潛能；平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)明確SP和NSP細(xì)胞的惡性程度。
　　三、雌激素和雙酚

6、A對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞作用的研究：E2和BPA干預(yù)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞比例；E2和BPA干預(yù)后免疫印跡法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物c-kit和ABCG2蛋白的表達(dá)；CCK-8分析和流式細(xì)胞周期分析確認(rèn)E2和BPA對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株的促增殖作用；CCK-8分析了解E2和BPA對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株的SP和NSP細(xì)胞各亞型的促增殖作用。
　　結(jié)果：
　　一、SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的檢測(cè)及檢測(cè)條

7、件的優(yōu)化：60min的Hoechst孵育時(shí)間、50μmol/L的維拉帕米濃度可有效于SK-N-SH細(xì)胞株檢測(cè)出SP細(xì)胞；SK-N-SH細(xì)胞株特異地對(duì)低濃度的Hoechst毒性反應(yīng)敏感，其機(jī)理與Hoechst干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和凋亡有關(guān)；對(duì)比不同濃度Hoechst的檢測(cè)效果和毒性，最終選擇5μM的濃度用于SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞分選；以上述的檢測(cè)條件檢測(cè)出SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞比例為3.6±0.2％。
　　二、

8、SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的分選及其干細(xì)胞特性的鑒定：成功于SK-N-SH細(xì)胞株中分選出SP和NSP細(xì)胞；SP細(xì)胞胞體小、有神經(jīng)絲樣突起，貼壁能力弱、集聚性生長，核質(zhì)比高、胞漿細(xì)胞器少，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物、低表達(dá)分化細(xì)胞標(biāo)志物，增殖速度快，具有快速分化能力，克隆形成能力強(qiáng)、侵襲性高、裸鼠成瘤率高；SK-N-SH細(xì)胞株的NSP細(xì)胞胞體大、無神經(jīng)絲樣突起，貼壁能力強(qiáng)、單層生長，核質(zhì)比低、胞漿細(xì)胞器多，低表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物、高表達(dá)分化細(xì)胞標(biāo)志

9、物，增殖速度慢，具有緩慢的分化能力，克隆形成能力消失、侵襲性弱、無裸鼠成瘤能力。
　　三、雌激素和雙酚A對(duì)SK-N-SH細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞作用的研究：E2和BPA均能使SK-N-SH細(xì)胞株的SP細(xì)胞比例下降直至檢測(cè)不出、均能下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物c-kit和ABCG2蛋白的表達(dá)；E2和BPA均對(duì)SK-N-SH母細(xì)胞有顯著的體外促增殖作用，但對(duì)其NSP細(xì)胞亞型的促殖作用較對(duì)其SP細(xì)胞亞型更顯著。
　　結(jié)論：
　　1.SP細(xì)胞研究時(shí)