HDAC1異常表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥程度的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是位于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生癌變后所產(chǎn)生的原發(fā)性顱腦腫瘤，是神經(jīng)外科常見惡性腫瘤?；瘜W(xué)藥物治療是膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除后的重要手段，但因其生長(zhǎng)部位具有特殊性以及血腦屏障的作用而嚴(yán)重影響化療效果，膠質(zhì)瘤耐藥性極強(qiáng)等，是膠質(zhì)瘤化療失敗的主要原因。因此研究化療藥耐藥相關(guān)作用機(jī)制，尋找耐藥相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)臨床治療有指導(dǎo)意義。HDAC1屬于第一類組蛋白去乙?；?，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬建立HDAC1過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株，觀察不同水平的HD

2、AC1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG耐藥程度的影響，并探討其作用機(jī)制，進(jìn)一步為提高膠質(zhì)瘤化療藥敏感性奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　探討組蛋白去乙?；?HDAC1過表達(dá)及低表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤化療藥耐藥程度的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：
　　1. HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1的建立
　　從膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)過RT-PCR反應(yīng)，TA克隆，酶切鑒定及基因序列分析鑒定

3、，回收純化HDAC1基因片段，將HDAC1片段與空載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro連接得連接產(chǎn)物pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro，轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，細(xì)胞293 T包裝病毒，感染U87MG細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，Western Blot免疫印跡法測(cè)定HDAC1表達(dá)量，建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1及其陰性對(duì)照U87MG-Control。
　　2. HDAC1低表

4、達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi的建立
　　針對(duì)HDAC1目的序列，按照shRNA要求合成oligo DNA，經(jīng)退火反應(yīng)形成雙鏈，與GV-248載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取，293T細(xì)胞包裝病毒，感染膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，Western Blot免疫印跡法測(cè)定HDAC1表達(dá)量，建立HDAC1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其陰性對(duì)照U87MG-NC-RNAi。
　　第二部分：

5、
　　HDAC1過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)化療藥耐藥程度的影響
　　將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為HDAC1過表達(dá)組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）和HDAC1低表達(dá)組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）。分別用VM-26和DDP兩類藥物處理兩組細(xì)胞。VM-26藥物作用終濃度分別為：0.1、0.5、2.5和12.5μg/mL；DDP藥物作用終梯度濃度分別為：0.08、0.4、2和10μg/mL。藥

6、物VM-26或DDP作用細(xì)胞48 h后，MTT法分別檢測(cè)過表達(dá)組和下調(diào)組細(xì)胞存活率的改變；Hoechst/PI雙染法檢兩組凋亡形態(tài)學(xué)變化，Western Blot檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.正確擴(kuò)增 HDAC1基因編碼區(qū)并包裝過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro，建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，Weste

7、rn blot結(jié)果顯示U87MG-HDAC1組中HDAC1蛋白的表達(dá)較U87MG-Control組顯著增加（1.148±0.024vs0.580±0.003，P<0.01）。
　　2.正確設(shè)計(jì)合成HDAC1 shRNA雙鏈結(jié)構(gòu)并包裝低表達(dá)慢病毒載體GV248-HDAC1-RNAi，建立HDAC1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株U87MG-HDAC1-RNAi， Western blot結(jié)果顯示U87MG-HDAC1-RNAi組中HDAC1蛋白的表

8、達(dá)較U87MG-NC-RNAi組顯著下調(diào)（0.705±0.009 vs0.352±0.006，P<0.01）。
　　第二部分：
　　HDAC1的過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)藥物處理后耐藥程度的影響
　　MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VM-26和 DDP兩種藥物分別處理后，過表達(dá)組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）兩細(xì)胞株存活率均呈濃度依懶性地降低；在相同的 VM-26或 DDP各個(gè)濃度，U87MG-HDAC1存

9、活率顯著高于U87MG-Control細(xì)胞株（P<0.05）；VM-26作用下U87MG-HDAC1的IC50值是U87MG-Control的3.11倍， DDP作用下 U87MG-HDAC1的 IC50值是U87MG-Control的2.60倍。VM-26和 DDP兩藥物分別處理后，低表達(dá)組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩株細(xì)胞存活率均隨藥物濃度增大而降低；在同一VM-26或DDP濃度下，U87MG

10、-HDAC1-RNAi存活率明顯低于 U87MG-NC-RNAi細(xì)胞株（P<0.05）；VM-26作用下 U87MG-HDAC1-RNAi的IC50值是U87MG-NC-RNAi的0.49倍，DDP作用下U87MG-HDAC1-RNAi的IC50值是U87MG-NC-RNAi的0.62倍。
　　Hoechst33258/PI雙染法觀察，VM-26和DDP兩種藥物處理后，過表達(dá)組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control

11、）兩細(xì)胞株均隨濃度增大，凋亡細(xì)胞比例增大；在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下，U87MG-HDAC1細(xì)胞株凋亡細(xì)胞比例顯著低于 U87MG-Control。VM-26和 DDP兩種藥物處理后，低表達(dá)組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩細(xì)胞株均隨濃度增大，凋亡細(xì)胞比例增大；在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下，U87MG-HDAC1-RNAi細(xì)胞株凋亡細(xì)胞比例顯著高于U87MG-Control-RNAi

12、。
　　Western blot免疫印跡結(jié)果顯示，VM-26和DDP兩種藥物處理后，過表達(dá)組（U87MG-HDAC1& U87MG-Control）兩細(xì)胞株，隨藥物濃度增大，Bax、Caspase-3隨之增大，Bcl-2表達(dá)則降低；在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下， U87MG-HDAC1的Bcl-2/Bax值顯著高于U87MG-Control（P<0.05），而Caspase3表達(dá)量顯著低于 U87MG-Control（P<

13、0.05）。VM-26和 DDP兩種藥物處理后，低表達(dá)組（U87MG-HDAC1-RNAi& U87MG-NC-RNAi）兩細(xì)胞株，隨藥物濃度增大，Bax、Caspase-3表達(dá)均增強(qiáng)，Bcl-2則降低；在相同的VM-26或DDP各個(gè)濃度下，U87MG-HDAC1-RNAi的 Bcl-2/Bax值顯著低于 U87MG-NC-RNAi（P<0.05），而Caspas-3表達(dá)量顯著高于U87MG-NC-RNAi（P<0.05）。