黃柏堿抗ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：黃柏是一種常用中藥，在我國分布廣泛、資源豐富，在《中國藥典》中黃柏的活性成分檢測包括小檗堿和黃柏堿，但是在工業(yè)生產(chǎn)上黃柏常常作為提取小檗堿的主要原料，而含有黃柏堿的工業(yè)廢水排放到環(huán)境中造成了大量的浪費(fèi)和污染。本課題主要是模擬工業(yè)生產(chǎn)對黃柏提取小檗堿后的廢液進(jìn)行黃柏堿的回收提取工藝研究，并且對黃柏堿進(jìn)行了系統(tǒng)的抗氧化活性及其相關(guān)機(jī)制研究，其意義在于加強(qiáng)黃柏資源的合理利用以及環(huán)境保護(hù)作用，同時(shí)為黃柏堿的臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2、>　　方法與結(jié)果：⑴采用工業(yè)上常用的大孔樹脂進(jìn)行黃柏堿進(jìn)行富集，然后采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，整個(gè)過程使用TLC鑒別和HPLC進(jìn)行含量和純度的分析。結(jié)果顯示，流出液的體積在5.5BV時(shí)黃柏堿開始出現(xiàn)滲漏，因此最大上樣量為5BV；黃柏堿通過大孔樹脂富集回收后的純度約為70％，回收率為71.76%；反相硅膠柱層析采用甲醇-水梯度洗脫，用60%的甲醇加少量濃氨水能夠迅速將大部分黃柏堿洗脫下來，減壓濃縮后加一定量的甲醇置4℃冰箱中結(jié)晶，經(jīng)

3、HPLC分析純化后的黃柏堿純度可達(dá)到90%，將此結(jié)晶加少量濃鹽酸溶解后再加適量甲醇進(jìn)行重結(jié)晶可得純度為98%以上的黃柏堿單體，最后的整體回收率約35.59%。⑵黃柏堿進(jìn)行體外抗氧化活性分析主要采用了化學(xué)分析法以及熒光分光光度法。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃柏堿有較好的清除 ABTS+、DPPH自由基、O2.-的作用，并且在相同濃度下黃柏堿清除DPPH的能力比小檗堿強(qiáng)；本實(shí)驗(yàn)還利用A549細(xì)胞模型評價(jià)了黃柏堿清除 ROS的能力，結(jié)果顯示黃柏堿的濃度

4、為5、25μg/ml時(shí)在細(xì)胞中有顯著的清除ROS的作用。⑶以斑馬魚胚胎為模型對黃柏堿進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性分析，主要采用DCFH-DA、DPPP、AO熒光染料處理后再用熒光顯微鏡拍照并分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示不同濃度的黃柏堿對由AAPH引起的斑馬魚胚胎死亡以及心跳異常等現(xiàn)象均有較好的保護(hù)效果，特別是200μg/ml的黃柏堿能夠在72h時(shí)將斑馬魚胚胎的存活率提高到90.26±1.40%；此外，黃柏堿在斑馬魚體內(nèi)還具有較好的清除ROS，降低脂質(zhì)過

5、氧化以及細(xì)胞死亡率的效果，特別是在清除ROS方面呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。⑷分別以斑馬魚胚胎和A549細(xì)胞為模型對黃柏堿的抗氧化機(jī)制進(jìn)行研究，主要使用了RT-PCR以及蛋白免疫印跡法分別對抗氧化通路上的關(guān)鍵基因和蛋白進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，在斑馬魚體內(nèi)100μg/ml的黃柏堿能夠顯著提高 AKT、Nrf2、HO-1和Bcl-2基因的表達(dá)而對NF-κB和P53基因具有下調(diào)的作用；通過WB分析發(fā)現(xiàn)黃柏堿能夠抑制AKT以及NF-κB的磷酸化作用，加入通

6、路抑制劑LY294002和BAY11-7082后能夠顯著抑制AKT和NF-κB對應(yīng)的下游蛋白的表達(dá)，而黃柏堿與此有相同的作用。
　　結(jié)論：在對黃柏堿的回收提取過程中主要采用了醫(yī)藥工業(yè)上常用的大孔樹脂和C18硅膠填料，在洗脫劑方面主要使用的是乙醇、甲醇和水，它們廉價(jià)易得且回收方便對環(huán)境污染少。此外研究顯示黃柏堿在體內(nèi)外均具有較好的抗氧化作用，體外抗氧化活性評價(jià)發(fā)現(xiàn)黃柏堿清除DPPH自由基的效果比小檗堿強(qiáng)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)黃柏堿在斑馬魚胚