氧化應(yīng)激與男性不育相關(guān)因素系列研究.pdf

1、第一部分氧化應(yīng)激對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力、膜功能及精子線粒體膜電位等的影響 目的:觀察氧化應(yīng)激對(duì)正常精子的運(yùn)動(dòng)能力、存活率、膜完整性以及膜脂類過(guò)氧化反應(yīng)等因素的影響，以及氧化應(yīng)激對(duì)精子線粒體膜電位的變化。 方法:采用簡(jiǎn)易上游法選擇具有正常生理功能的人精子作為正常精子模型，應(yīng)用FeSO<,4>/H<,2>O<,2>體系產(chǎn)生活性氧(ROS)，與精子模型孵育后，運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)，分別觀察30min,60min精子運(yùn)

2、動(dòng)方式參數(shù)的變化。應(yīng)用伊紅一Y染色法觀察ROS對(duì)精子存活率的影響，低滲膨脹法檢測(cè)精子膜完整性，巴氏染色法檢測(cè)精子頂體完整率。應(yīng)用硫巴比妥酸法(TBA)測(cè)定精子懸液中膜脂類過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。利用新型熒光探針JC一1標(biāo)記精子線粒體，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)JC-1熒光強(qiáng)度的變化。 結(jié)果: 1.與對(duì)照組相比，正常精子模型與ROS孵育30min后，除H<,2>O<,2>O.05mmo1/L濃度組之外，各組VCL,VS

3、L,VAP均明顯下降，BCF,MAD,STR等無(wú)明顯改變。高濃度組ALH,LIN與對(duì)照組比較明顯下降。 2.隨著氧化劑濃度的增高(H<,2>O<,2>O.5-5mmo1/L)，存活率、低滲膨脹率明顯下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異，并且具有劑量依賴性。孵育60min后，各上述指標(biāo)較30min值下降，但二者無(wú)顯著性差異。 3.除H<,2>O<,2>O.05mmo1/L組外，各組MDA含量與對(duì)照組比較有顯著性差異。 4

4、.ROS對(duì)頂體完整率無(wú)明顯影響。 5.正常精子線粒體維持較高的膜電位，JC-1在線粒體內(nèi)形成聚合物，紅色熒光占主導(dǎo)地位。FeSO<,4>/H<,2>O<,2>體系導(dǎo)致線粒體膜電位下降，JC-1聚合物分解成單體，紅色熒光強(qiáng)度減弱。 結(jié)論:活性氧可引起正常精子運(yùn)動(dòng)能力的下降，影響精子存活率、膜完整性和膜脂類過(guò)氧化反應(yīng)，并導(dǎo)致精子線粒體膜電位下降，可見ROS為精子運(yùn)動(dòng)功能障礙的病因之一。JC-1熒光探針可用于檢測(cè)精子線粒體膜電

5、位，JC-1結(jié)合流式細(xì)胞儀是一種較理想的檢測(cè)線粒體膜電位的手段。第二部分體外受精周期中精子DNA完整性與受精率的相關(guān)研究 目的:受精是體外受精一胚胎移植過(guò)程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。受精障礙會(huì)導(dǎo)致可移植胚胎數(shù)目的減少甚至無(wú)胚胎可移植，從而直接影響妊娠結(jié)局。精子、卵子和精卵結(jié)合三方面均是影響受精過(guò)程的重要研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)將精子作為主要研究對(duì)象，探討精子與受精之間的關(guān)系，尤其是精子DNA完整性與受精率的相關(guān)性。 方法:選擇60

6、例IVF和ICSI病例，女方取卵數(shù)目在10-25枚之間。按照受精率分組，受精率>70[％]的病例組成受精正常組;受精率<30[％]和完全不受精病例組成受精障礙組，比較兩組病例臨床資料:患者夫婦年齡、不孕年限、不孕原因、男方精液質(zhì)量、取卵數(shù)、受精數(shù)、胚胎數(shù)及妊娠結(jié)局等。比較兩組病例男方精液，利用TUNEL方法檢測(cè)精子DNA完整性，分析精子DNA完整性與受精率的相關(guān)性。同時(shí)，檢測(cè)精子24h存活率并分析其與受精率的相關(guān)性。 結(jié)果:

7、 1.兩組病例患者夫婦年齡、不孕年限、超促排卵方案的應(yīng)用方面無(wú)顯著性差異。 2.兩組病例中輸卵管因素、排卵障礙、原因不明性不孕的分布無(wú)顯著性差異。受精障礙組26例中有12例有男性因素單獨(dú)或合并存在，受精正常組34例中7例有男性因素單獨(dú)或合并存在，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，二者有顯著性差異。其中，(少)弱精子癥為男性因素的主要方面，但兩組病例(少)弱精子癥的比重并無(wú)顯著性差異。 3.兩組病例男方精液密度、精液量、精子活動(dòng)率、a+

8、b級(jí)精子的百分比以及精子畸形率之間無(wú)顯著性差異。 4。兩組病例在取卵數(shù)目方面無(wú)顯著性差異。但受精個(gè)數(shù)和本周期獲得的胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目差異顯著，受精障礙組明顯低于正常組。 5.受精障礙組26例患者有5例獲得臨床妊娠，其中包括1例發(fā)生早期流產(chǎn);1例異位妊娠:2a例未妊娠。受精正常組34例患者有13例獲得臨床妊娠，其中2例發(fā)生早期流產(chǎn);1例異位妊娠:1例生化妊娠;19例未妊娠。兩組臨床妊娠率比較有顯著性差異。 6.受

9、精障礙組精子DNA完整性與受精正常組之間有顯著性差異。 7.兩組病例精子24h存活率無(wú)顯著性差異。 結(jié)論: 1男性因素可能對(duì)受精產(chǎn)生重要的影響，其作用不可低估。 2.精液常規(guī)檢查項(xiàng)目如精液密度、精液量、精子活動(dòng)率等不能有效預(yù)測(cè)精子的受精能力。 3.體外受精周期中精子DNA完整性與受精率成正相關(guān)，精子DNA完整性可作為受精能力的篩查指標(biāo)之一。 4.TUNEL染色聯(lián)合熒光顯微鏡可以迅速方便地檢

10、測(cè)精子DNA完整性。第三部分補(bǔ)腎活血中藥對(duì)弱精子癥大鼠抗氧化作用的研究 目的:隨著對(duì)氧化損傷認(rèn)識(shí)的不斷深入，抗氧化藥物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。中藥中有許多藥物具有抗氧化作用。近年來(lái)認(rèn)為，氧化應(yīng)激是引起男性不育的一個(gè)重要原因，并且與弱精子癥關(guān)系密切。本文通過(guò)建立弱精子癥大鼠模型，研究補(bǔ)腎活血中藥對(duì)雄性大鼠附辜精子的抗氧化作用。 方法:取40只SD大鼠隨機(jī)分為四組:模型組、對(duì)照組、中藥低劑量組和高劑量組。模型組每日給予200

11、mg/kg奧硝唑灌胃，正常對(duì)照組每日給予0.5[％]梭甲基纖維素鈉灌胃，中藥組每日給予200mg/kg奧硝唑灌胃的同時(shí)，給予不同劑量補(bǔ)腎活血中藥灌胃。3周后摘取大鼠睪丸、附睪，檢測(cè)大鼠附睪精子的活動(dòng)率;利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)制備附睪勻漿，檢測(cè)大鼠附睪勻漿丙二醛(MDA)濃度、超氧化物歧化酶(SOD)濃度、谷膚甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶X同工酶(LDH-X)濃度、α-葡糖苷酶濃度及果糖濃度的變化。 結(jié)果: 1

12、.奧硝唑組大鼠附睪精子活動(dòng)率下降，附睪勻漿MDA濃度升高。 2.中藥低、高劑量組精子活動(dòng)率和MDA濃度與正常組比較，均無(wú)明顯差異。中藥組SOD,GSN-Px濃度較奧硝唑組升高，LDH-X,。α一葡糖苷酶有升高的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。 結(jié)論: 1.奧硝唑灌胃能夠成功制作弱精子癥大鼠模型，對(duì)附睪精子的氧化損傷是其中的機(jī)制之一。 2.補(bǔ)腎活血中藥通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，增加附睪功能，從而發(fā)揮抗氧