鎂及鎂合金可溶性降解產(chǎn)物對血管平滑肌細(xì)胞表型的影響.pdf

1、正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)為增殖低、合成低的收縮型表型。當(dāng)血管微環(huán)境發(fā)生異常時（如動脈粥樣硬化），收縮型VSMC向多種表型方向轉(zhuǎn)變。血管支架的植入是治療動脈粥樣硬化主要方法之一，鎂基金屬材料因其優(yōu)越的機(jī)械特性和生物安全性，成為新一代血管支架的代表材料。但是因鎂的快速降解而導(dǎo)致降解產(chǎn)物的大量產(chǎn)生顯著影響血管微環(huán)境、進(jìn)而影響血管組織細(xì)胞（尤其是VSMC）。以往關(guān)于鎂降解產(chǎn)物對VSMC影響的研究多集中于對細(xì)胞活力、增殖及凋亡的

2、考察，忽略了對其表型轉(zhuǎn)變的作用。鑒于VSMC顯著的可塑性及不同表型VSMC均不同程度上參與了動脈斑塊的形成和發(fā)展的事實(shí)，本文以純鎂及AZ31鎂合金的浸提液同收縮型血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，從細(xì)胞及分子水平上考察了鎂基金屬可溶性降解產(chǎn)物對VSMC表型轉(zhuǎn)變的影響、并對介導(dǎo)表型轉(zhuǎn)變的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探索。
　　首先，本文改進(jìn)膠原酶、胰肽酶復(fù)合酶二步法消化、建立了一種大鼠的胸主動脈收縮型血管平滑肌細(xì)胞的分離制備方法。該方法操作簡捷易行、

3、重復(fù)性好，所得細(xì)胞活力佳、純度高，并且細(xì)胞的收縮表型特征顯著。
　　其次，取含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基對純鎂及AZ31鎂合金分別進(jìn)行一天和三天的浸提，獲得四種浸提液。通過對材料進(jìn)行SEM、極化曲線和EIS以及對浸提液進(jìn)行離子含量及pH的測定，考察純鎂及AZ31鎂合金在含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中的腐蝕行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純鎂的腐蝕速率大于AZ31鎂合金;腐蝕過程中均產(chǎn)生了大量的可溶性Mg2+，AZ31鎂合金腐蝕后

4、pH值大于純鎂;但純鎂腐蝕呈層片狀，時間越長，片層越光滑細(xì)膩，AZ31鎂合金主要為點(diǎn)腐蝕，時間越長，腐蝕坑越大，越不均一。
　　隨后，取四種浸提液、按照不同稀釋比例處理收縮型血管平滑肌細(xì)胞，考察細(xì)胞增殖、遷移和凋亡行為的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純鎂浸提液所可顯著促進(jìn)共培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的的生長，細(xì)胞的增殖、遷移均增強(qiáng)，而凋亡被抑制;浸提時間、浸提液所占比例與這些細(xì)胞的這些反應(yīng)呈正相關(guān)。AZ31的浸提液輕微的抑制了血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷

5、移。
　　進(jìn)一步采用ICC、QRT-PCR、WB分析手段，考察浸提液對共培養(yǎng)的收縮型VSMC的基因表型的影響。結(jié)果表明，兩種材料的浸提液處理后，細(xì)胞中Myh11、a-SMA、Smtn、Sm22a等收縮型VSMC的表型基因的表達(dá)水平均明顯下降，且下降幅度依賴浸提時間和浸提液比例的變化，表明鎂基金屬材料的可溶性降解物削弱血管平滑肌細(xì)胞維持收縮型性狀的能力;反之，一系列炎性細(xì)胞的表型基因(包括表面黏附分子Vcam1和炎性細(xì)胞因子ILIB

6、、趨化因子Ccl2、Ccl20)的表達(dá)水平整體上調(diào)，表明經(jīng)過浸提液處理后血管平滑肌細(xì)胞炎性表型特征明顯增強(qiáng)。
　　比較兩種鎂基金屬材料浸提液后，本文采用MgSO4配制的(2.5、5、25、50) mmol/L含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基處理收縮型表型的血管平滑肌細(xì)胞，考察Mg2+對細(xì)胞收縮型標(biāo)記基因和蛋白以及炎癥表型基因的影響。結(jié)果表明隨著Mg2+含量的增加，VSMC收縮型分子標(biāo)記基因的表達(dá)降低而炎性表型的分子標(biāo)記基因的

7、表達(dá)增強(qiáng)。說明鎂基金屬腐蝕釋放的可溶性Mg2+可能部分介導(dǎo)了VSMC從收縮型向炎性表型轉(zhuǎn)變的發(fā)生。
　　最后，本文分析了浸提液和單一鎂離子添加對共培養(yǎng)的收縮型VSMC中兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Myocardin及Klf4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VSMC收縮型性狀基因的促進(jìn)性調(diào)控因子Myocardin的mRNA和蛋白水平均隨著處理時間下降、且和處理濃度相關(guān);而抑制性的轉(zhuǎn)錄因子Klf4的表達(dá)則被顯著提高。說明鎂基金屬腐蝕釋放的鎂離子可引起兩