Galectin-3通過調(diào)控E-n-cadherin和CD44的表達促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、研究背景
　　半乳糖凝集素(galectin)是凝集素超級家族的一個家族，屬于β-半乳糖苷連接蛋白，對β-半乳糖苷有高度親和性。迄今為止發(fā)現(xiàn)的半乳糖凝集素共有15種，并且都擁有一個或兩個高度保守的糖識別域(carbohydrate cognition domain，CRD)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是galectin家族中唯一的嵌合型代表，擁有一個CRD和一個串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域。Galectin-3(gal-3)廣泛表

2、達于正常組織與腫瘤細胞，在細胞內(nèi)合成，能夠穿梭于胞漿和胞核，還可以轉(zhuǎn)運到細胞膜上，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增值、遷移、凋亡、粘附和血管形成。Gal-3在大多數(shù)腫瘤細胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達，并且其表達水平與腫瘤的惡性程度存在著密切聯(lián)系。近年來的研究表明，多數(shù)腫瘤患者血清中g(shù)al-3的濃度明顯高于正常人，主要集中在乳腺癌、肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等患者。血清中的gal-3能夠使MUC1極化分布，將細胞表面的粘附分子(cell adhesion

3、molecules，CAMs)暴露出來，從而促進腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞之間的粘附。也有文獻報道，gal-3的表達可誘導(dǎo)整合素的活化，從而促進腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的纖連蛋白和層粘連蛋白的粘附。細胞粘附分子能夠調(diào)節(jié)細胞與細胞之間和細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附，在腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)能夠與同型的E-cadherin結(jié)合，起到維持上皮細胞極性和完整性的作用，并且還參與調(diào)控腫瘤細胞的聚集，因此

4、被廣泛認為是腫瘤抑制因子，具有抑制腫瘤遷移的作用。而N-鈣粘蛋白(E-cadherin)和CD44具有促進腫瘤細胞遷移的作用，也能夠促進腫瘤的遷移和與血管內(nèi)皮細胞之間的粘附。尤其是N-cadherin的表達也能夠抑制E-cadherin調(diào)節(jié)的粘附作用，并且在引起腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著比E-cadherin的減少更為重要的作用。然而目前gal-3是否能夠調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和CD44等粘附分子的表達來促進腫瘤

5、細胞的遷移？細胞外和細胞內(nèi)的gal-3對這些粘附分子的調(diào)控作用以及對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用有何不同？目前這些調(diào)控機制尚未有文獻報道。因此，本論文選用表達gal-3的非小細胞肺癌A549細胞和不表達gal-3的前列腺癌PC3細胞，分別研究細胞內(nèi)和細胞外gal-3是否調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和CD44的表達來影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移和粘附，調(diào)控機制如何？選用的這兩種細胞均是MUC1低表達，從而避開MUC1對本論文中研究的ga

6、l-3調(diào)控粘附分子作用與機制的影響。
　　研究方法和結(jié)果
　　1.細胞內(nèi)gal-3對粘附分子的調(diào)控及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用
　　(1)采用siRNA技術(shù)干擾A549細胞內(nèi)gal-3的表達后，采用Western blotting方法檢測幾種粘附分子的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin、N-cadherin和CD44三種粘附分子的表達均明顯降低，提示細胞內(nèi)gal-3能夠上調(diào)E-cadherin，N-cadherin和CD4

7、4的表達水平。(2)通過流式細胞術(shù)檢測A549的聚集情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)gal-3對A549的聚集無明顯影響。(3)采用siRNA技術(shù)干擾A549細胞gal-3的表達后，A549細胞與HUVECs之間的粘附能力明顯降低。提示細胞內(nèi)gal-3可促進腫瘤細胞A549與HUVECs細胞間的粘附。采用siRNA技術(shù)為探討該作用的分子機制是否與β-catenin入核有關(guān)，通過胞漿、胞核分離提取法，并采用Western blotting檢測A549

8、細胞胞漿、胞核的β-catenin的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gal-3的siRNA組的β-catenin入核減少，提示細胞內(nèi)gal-3可促進β-catenin入核。進一步采用β-catenin抑制劑ICG-001來確證β-catenin入核是細胞內(nèi)gal-3促進A549細胞與HUVECs間粘附的關(guān)鍵因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用ICG-001可抑制兩種細胞間的粘附，而在ICG-001存在下，干擾gal-3的基因表達后不再影響兩種細胞間的粘附。說明gal-3可

9、能是通過促進β-catenin入核調(diào)控粘附分子的表達，進而調(diào)控A549細胞與HUVECs間的粘附。(4)確定參與細胞內(nèi)gal-3促進腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞間粘附作用的粘附分子種類及調(diào)控機制。上述結(jié)果已發(fā)現(xiàn)Gal-3可上調(diào)E-cadherin，N-cadherin和CD44的表達水平，那么三種粘附分子是否均參與了兩種細胞間的粘附作用呢？首先，檢測HUVECs細胞E-cadherin和N-cadherin的表達水平，發(fā)現(xiàn)HUVECs表達N-

10、cadherin，但不表達E-cadherin。E-cadherin和CD44的配體是同型的cadherin分子，而CD44的配體是透明質(zhì)酸，并且透明質(zhì)酸幾乎存在于所有細胞表面。提示gal-3促進A549細胞與HUVECs細胞間的粘附作用與上調(diào)E-cadherin的表達無關(guān)，而是與N-cadherin和CD44相關(guān)。接下來檢測細胞內(nèi)的gal-3與N-cadherin和CD44的調(diào)控關(guān)系。采用ICG-001阻斷β-catenin的下游通路

11、，并利用Western blotting方法檢測N-cadherin和CD44的表達變化。結(jié)果顯示，ICG-001能夠使A549的N-cadherin的表達降低，但對CD44的表達無顯著影響。但是在ICG-001的存在下，細胞內(nèi)gal-3干擾后不再影響A549細胞中N-cadherin和CD44的表達，說明細胞內(nèi)gal-3是通過β-catenin入核上調(diào)N-cadherin和CD44的表達，從而促進A549細胞與HUVECs之間的粘附作

12、用。(5)采用劃痕實驗和transwell實驗檢測細胞內(nèi)gal-3對A549細胞的遷移和侵襲能力的影響。本次試驗分別觀察單用gal-3 siRNA或10μMβ-catenin抑制劑ICG-001組或兩者合用后A549細胞的遷移和侵襲能力。而gal-3干擾組中和β-catenin抑制劑ICG-001組A549細胞的遷移能力也明顯下降。兩者合用組A549細胞幾乎無明顯的遷移能力。提示，阻斷β-catenin/TCF基因轉(zhuǎn)錄能夠增強干擾gal

13、-3表達后抑制遷移的作用。促進β-catenin入核是gal-3促遷移作用的重要機制之一。
　　2.細胞外的gal-3對粘附分子的調(diào)控及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　(1) Gal-3通過EGFR介導(dǎo)可下調(diào)E-cadherin的表達。本課題組前期實驗已經(jīng)證明在EGF的存在下，細胞外的gal-3能夠持續(xù)性激活表皮生長因子受體(EGFR)，并使E-cadherin的表達降低。本論文中我們進一步檢測細胞外gal-3調(diào)控E-cadher

14、in表達的機制。在PC3細胞中加入EGF和gal-3共孵育1h后，采用Westernblotting實驗檢測相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞外gal-3可通過NF-κB相關(guān)信號通路下調(diào)PC3細胞內(nèi)的E-cadherin的表達。(2)采用免疫共沉淀法檢測E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的變化，結(jié)果顯示細胞外gal-3能夠下調(diào)E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的形成。(3)通過流式細胞儀檢測PC3細胞的同型聚集情況，結(jié)

15、果顯示，在EGF的存在下，gal-3能夠抑制PC3的聚集。(4)胞外gal-3能進入到細胞內(nèi)，上調(diào)N-cadherin和CD44的表達，但不影響E-cadherin的表達。該實驗是在無EGF的存在下，PC3細胞經(jīng)gal-3處理0、1、2、4、8h之后，檢測細胞內(nèi)gal-3的表達水平，觀察細胞外的gal-3能否進入細胞內(nèi);同時檢測對E/N-cadherin和CD44的表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2h時進入細胞的gal-3最多，之后逐漸下降。與此

16、同時，E-cadherin的表達沒有顯著的變化，而N-cadherin和CD44在8h的時候表達最高。由于之前檢測了HUVECs細胞并不表達E-cadherin，細胞外的gal-3調(diào)控腫瘤細胞與HUVECs之間的粘附無需E-cadherin的參與。接下來的實驗便不再加入EGF。(5)檢測了細胞外的gal-3對A549和PC3細胞與HUVECs之間粘附的影響，結(jié)果顯示，外加人重組的gal-3能夠促進A549和PC3細胞與HUVECs間的粘

17、附;同時能夠上調(diào)N-cadherin和CD44的表達。(6)為了驗證細胞外的gal-3是否內(nèi)吞進入到細胞內(nèi)并促進β-catenin的入核，采用胞漿、胞核分離提取法和western blotting實驗檢測胞漿、胞核的gal-3和β-catenin的變化。結(jié)果顯示胞漿、胞核里的gal-3和β-catenin隨著加入的gal-3濃度的增加而增加，說明細胞外的gal-3進入到細胞里面，進而促進β-catenin入核，調(diào)控N-cadehrin和

18、CD44的表達。
　　最后進一步確證了N-cadherin和CD44參與gal-3促進的A549細胞與HUVECs間的粘附。采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)這兩個粘附分子的表達后，結(jié)果顯示N-cadherin表達的下調(diào)對A549細胞與HUVECs之間的粘附的影響大于CD44表達的下調(diào)所造成的影響。并且在這兩個粘附分子表達下調(diào)之后加入了gal-3，結(jié)果顯示干擾CD44組粘附能力恢復(fù)到接近空白對照組細胞的粘附能力。因此，N-cadherin

19、在gal-3誘導(dǎo)的腫瘤細胞與HUVECs之間的粘附中發(fā)揮了比CD44更重要的作用。
　　實驗結(jié)論:
　　1.細胞內(nèi)的gal-3能夠增加β-catenin入核上調(diào)N-cadherin和CD44的表達，從而促進A549細胞與HUVECs間的粘附。
　　2.細胞內(nèi)的gal-3對A549細胞間的同型聚集沒有顯著影響。
　　3.細胞內(nèi)的gal-3能夠增加β-catenin入核促進A549細胞的侵襲和遷移。
　　4.在

20、EGF的存在下，細胞外的gal-3能夠通過PI3K/P-Akt/NF-kB/ZEB1信號通路下調(diào)E-cadherin的表達，同時上調(diào)N-cadherin的表達，從而抑制PC3細胞的同型聚集。
　　5.細胞外的gal-3能夠進入細胞內(nèi)，通過增加β-catenin入核促進N-cadherin和CD44的表達，但并不影響E-cadherin的表達。
　　6.細胞外的gal-3能通過增加β-catenin入核促進腫瘤細胞與HUVEC