XIAP調(diào)控COMMD1蛋白降解參與鉛暴露擾亂大腦屏障銅轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究.pdf

1、鉛是自然界中廣泛存在的一種重金屬污染物。大量研究證實(shí)鉛暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有顯著的毒性作用，鉛暴露可以導(dǎo)致發(fā)育期高級(jí)神經(jīng)功能的損害，如認(rèn)知障礙、注意力分散和行為異常等；而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露與包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生同樣關(guān)系密切。鉛神經(jīng)毒性的機(jī)制目前尚未完全揭示，已有的研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可以影響神經(jīng)細(xì)胞即刻早期基因的表達(dá)、干擾神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的表達(dá)和功能、損害神經(jīng)突觸可塑性、誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異

2、?；罨⑵茐拇竽X屏障的結(jié)構(gòu)和功能、擾亂腦內(nèi)微量元素代謝等，提示鉛暴露誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制可能是涉及影響神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)及腦內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜的過(guò)程。
　　銅是人體必需的微量元素，大腦銅含量在體內(nèi)僅次于肝臟，適宜的銅水平對(duì)于大腦的發(fā)育及正常腦功能的維持的十分重要。但是另一方面，游離態(tài)銅離子具有強(qiáng)氧化性，過(guò)高的銅離子水平可破壞腦內(nèi)環(huán)境的氧化-還原平衡，與某些神經(jīng)退行性疾病可能存在病因?qū)W上的密切關(guān)聯(lián)。細(xì)胞銅代謝是通過(guò)各種銅轉(zhuǎn)運(yùn)體和伴侶分子的相

3、互作用而實(shí)現(xiàn)的，銅離子主要通過(guò)copper transporter1（CTR1）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后通過(guò)分子伴侶（如COX17、ATOX1等）轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體等細(xì)胞器；胞內(nèi)銅離子的排出主要通過(guò)位于高爾基網(wǎng)絡(luò)中的ATP7A或ATP7B轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究發(fā)現(xiàn)銅離子代謝結(jié)構(gòu)域包含體1（Copper Metabolism MURR1 Domain-containing1，COMMD1）可以通過(guò)影響ATP7A和ATP7B的表達(dá)而參與調(diào)控細(xì)胞銅離子代謝，而X連鎖

4、凋亡抑制蛋白（XIAP）對(duì)于COMMD1蛋白的降解起到重要的調(diào)控作用。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)：鉛暴露可以通過(guò)影響CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銅蓄積，提示鉛可能通過(guò)擾亂腦內(nèi)環(huán)境銅代謝而造成氧化應(yīng)激損傷。但是，XIAP介導(dǎo)的COMMD1降解是否參與鉛暴露影響腦內(nèi)銅代謝的過(guò)程？其分子調(diào)控機(jī)制是什么？目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　大腦屏障主要包括血腦屏障（Blood brain barrier,BBB）和血腦脊液屏障（bloo

5、d-cerebrospinal fluid barrier,BCB），二者是維持腦內(nèi)環(huán)境物質(zhì)的平衡的重要結(jié)構(gòu)。本研究通過(guò)建立體外BBB和BCB細(xì)胞模型，研究鉛對(duì)大腦屏障細(xì)胞銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探討XIAP調(diào)控的COMMD1降解在鉛暴露所致大腦屏障銅代謝紊亂中的作用及其機(jī)制，為明確鉛暴露擾亂腦內(nèi)環(huán)境銅離子平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、闡明其分子調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　目的：本課題以大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株RBE4和大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞株Z310為實(shí)

6、驗(yàn)對(duì)象，分別建立鉛暴露BBB和BCB體外模型，研究鉛對(duì)細(xì)胞銅代謝的影響，明確XIAP調(diào)控的COMMD1降解是否參與鉛暴露影響ATP7B和ATP7A等銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平、誘導(dǎo)胞內(nèi)銅蓄積的過(guò)程，并探討其上下游的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.RBE4和Z310細(xì)胞體外培養(yǎng)，分別建立鉛暴露BBB和BCB模型，采用MTT法篩選合適的鉛暴露劑量。
　　2.原子吸收分光光度法（AAS）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)銅水平。
　　3.RT-PCR

7、法檢測(cè)鉛暴露后細(xì)胞內(nèi)XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)鉛暴露后細(xì)胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A蛋白表達(dá)水平。
　　4.siRNA干涉技術(shù)抑制COMMD1表達(dá)，觀察ATP7A、ATP7B表達(dá)水平及細(xì)胞銅吸收量的變化。
　　5.構(gòu)建質(zhì)粒高表達(dá)XIAP，觀察COMMD1、ATP7A、ATP7B表達(dá)水平及細(xì)胞銅吸收量的變化。
　　6.分別設(shè)計(jì)含有野

8、生型和E3泛素連接酶位點(diǎn)突變型XIAP片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察COMMD1表達(dá)變化，明確其對(duì)COMMD1表達(dá)調(diào)控的功能靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.鉛暴露對(duì)RBE4和Z310細(xì)胞銅水平的影響RBE4和Z310細(xì)胞分別以含有2.5，5，10μmol/L醋酸鉛的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，置于37℃孵箱中以5μmol/L CuCl2孵育2h，AAS檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，鉛暴露后兩種細(xì)胞內(nèi)銅水平均顯著增高（P＜0.05），并呈劑量-

9、效應(yīng)關(guān)系。
　　2.鉛暴露對(duì)RBE4和Z310細(xì)胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響Western blot法結(jié)果顯示：2.5，5，10μmol/L醋酸鉛暴露24h后，或10μmol/L醋酸鉛暴露24h和48h后，與對(duì)照組相比，兩種細(xì)胞內(nèi)XIAP、ATP7B和ATP7A蛋白水平均顯著降低，COMMD1蛋白水平顯著增高（P＜0.01），呈劑量-和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。而與對(duì)照組相比，兩種細(xì)胞內(nèi)XI

10、AP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA水平均無(wú)顯著改變。
　　3.抑制COMMD1的表達(dá)對(duì)ATP7B的影響采用siRNA干涉COMMD1表達(dá)后，與scramble siRNA對(duì)照組相比，COMMD1 siRNA干涉組細(xì)胞在鉛處理后ATP7B蛋白水平降低幅度顯著縮?。≒＜0.05），而ATP7A蛋白水平無(wú)顯著改變（p＞0.05）。
　　4.干涉COMMD1的表達(dá)對(duì)RBE4和Z310細(xì)胞銅水平的影響使用siRNA干

11、涉COMMD1表達(dá)，與scramble siRNA對(duì)照組相比，COMMD1 siRNA干涉組細(xì)胞在鉛處理后胞內(nèi)銅水平的升高幅度顯著縮小（P＜0.05）。
　　5.高表達(dá)XIAP對(duì)COMMD1和ATP7B的影響通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒高表達(dá)XIAP，與空載（Vector）組相比，XIAP高表達(dá)組鉛處理后，所引起COMMD1蛋白水平增高、以及對(duì)ATP7B水平的下調(diào)作用均被顯著抑制（P＜0.05），但對(duì)ATP7A的水平無(wú)顯著影響（p＞0.05）。<

12、br>　　6.高表達(dá)XIAP對(duì)RBE4和Z310細(xì)胞銅水平的影響通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒高表達(dá)XIAP，與空載（Vector）組相比，XIAP高表達(dá)組鉛處理后，胞內(nèi)銅水平的升高幅度顯著縮?。≒＜0.05）。
　　7.XIAP調(diào)控COMMD1表達(dá)水平的功能結(jié)構(gòu)域的研究分別以含有野生型和E3泛素連接酶位點(diǎn)突變型XIAP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，高表達(dá)野生型XIAP實(shí)驗(yàn)組COMMD1蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而高表達(dá)E3泛素連接酶位點(diǎn)

13、突變型XIAP實(shí)驗(yàn)組COMMD1蛋白水平?jīng)]有顯著變化（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.鉛暴露可通過(guò)下調(diào)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP7A和ATP7B的蛋白水平，而導(dǎo)致血-腦屏障和血-腦脊液屏障細(xì)胞內(nèi)銅水平增高。
　　2.鉛暴露可以引起XIAP蛋白的表達(dá)水平降低，使其下游的COMMD1蛋白水平增高，進(jìn)而特異性地下調(diào)ATP7B的蛋白水平，造成細(xì)胞銅外排障礙和胞內(nèi)銅蓄積。
　　3.XIAP-COMMD1-ATP7B的調(diào)控發(fā)生于