囊泡轉(zhuǎn)運步驟的分辨及其調(diào)控機制研究.pdf

1、囊泡的轉(zhuǎn)運和融合涉及多個步驟和復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用。這些蛋白質(zhì)相互作用的時間和位點目前尚不清楚。一個主要的技術(shù)障礙是無法以較高的空間和時間分辨率確定囊泡轉(zhuǎn)運和融合過程中的不同步驟，因而不能揭示每個步驟具體的分子調(diào)控機制。利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡的優(yōu)勢，用熒光蛋白特異性地標(biāo)記了胞內(nèi)囊泡，并在活細(xì)胞中對囊泡進行了實時追蹤，研究比較了囊泡在轉(zhuǎn)運融合過程中經(jīng)過的不同步驟以及分子調(diào)控機制。本文比較了GTP 觸發(fā)的胞吐和Ca2＋觸發(fā)的胞吐機制差異，并

2、且發(fā)展了區(qū)分囊泡在轉(zhuǎn)運融合過程中經(jīng)過的不同步驟的方法，研究了具有重要生理意義的胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 的轉(zhuǎn)運過程和調(diào)控機制。 在細(xì)胞內(nèi)除了存在Ca2＋觸發(fā)的胞吐外，還存在一類不需要Ca2＋，由GTP 依賴的信號通路觸發(fā)的胞吐。但是對于這一類不依賴Ca2＋的胞吐機制了解的還非常少。在本研究中，利用雙通道的全內(nèi)反射熒光顯微鏡以PC12 細(xì)胞為模型，比較了高K＋溶液刺激下Ca2＋觸發(fā)的和Mastoparan（Mas）刺激下的致密

3、核心大囊泡的運動特性和融合機制。本研究發(fā)現(xiàn)Mas 刺激胞吐的囊泡主要都是一些沒有錨定的在胞漿中運動的囊泡，而對已經(jīng)錨定的囊泡沒有什么作用；Ca2＋觸發(fā)的主要是一些已經(jīng)錨定的囊泡。融合動力學(xué)分析和碳纖電極的數(shù)據(jù)顯示Mas 刺激的融合都是短暫的‘kiss and run’的方式，只能釋放少量的囊泡內(nèi)含物；在Ca2＋觸發(fā)下，融合孔開放狀態(tài)持續(xù)的時間要長些，可以釋放更多的囊泡內(nèi)含物。并且在Mas 的刺激下，囊泡一旦靠近細(xì)胞膜在很短的時間內(nèi)就可以

4、具有分泌的能力。研究結(jié)果表明，Ca2＋和GTP 觸發(fā)胞吐的差異不僅體現(xiàn)在觸發(fā)和最后的融合過程，也存在于囊泡的錨定和啟動過程。 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）是唯一一個響應(yīng)胰島素刺激轉(zhuǎn)運上膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族成員。盡管它在胰島素作用下的轉(zhuǎn)運上膜是血糖調(diào)控的一個重要過程，對于胰島素的調(diào)控機制的研究取得了一定的進展，但始終缺少很好的功能檢測方法可以將GLUT4 儲存囊泡轉(zhuǎn)運及融合過程中所經(jīng)過的一系列過程區(qū)分開來，因此不能清楚解釋整個

5、過程中的分子調(diào)控機制以及胰島素調(diào)控的關(guān)鍵步驟。在本研究中，開發(fā)了一個可以自動區(qū)分并系統(tǒng)的研究在3T3-L1 脂肪細(xì)胞中，囊泡錨定、啟動、融合過程的方法，并且發(fā)現(xiàn)了胰島素在提高囊泡錨定速率的同時, 更關(guān)鍵的調(diào)控步驟是在囊泡錨定在細(xì)胞膜下之后，使囊泡具有融合能力的啟動過程。進一步,還發(fā)現(xiàn)胰島素激活的PI3K 及其下游效應(yīng)物AS160 調(diào)控了囊泡的錨定過程。將這個方法和分子生物學(xué)的方法結(jié)合起來，將會大大地促進我們對胰島素調(diào)控GLUT4 轉(zhuǎn)運的