基于自組裝納米多肽及脂肪間充質(zhì)干細胞3D打印組織模型的研究.pdf

1、研究背景：
　　我們可以在多種組織中找到間充質(zhì)干細胞，它是一種擁有多向分化潛能的多功能干細胞，其具有容易分離擴增、多向分化和低免疫原性等特性。研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(Ad-MSCs)相對于其他干細胞，具有來源充足，取材方便，低創(chuàng)即得，易分離培養(yǎng)，生物學性狀穩(wěn)定等特征，因此研究者普遍認為其在組織工程學和再生醫(yī)學中是一種更為理想的種子細胞。
　　構成組織工程學支架的材料需要具備良好的生物相容性，較強可塑性，抗張強度大和無

2、免疫原性等特點。目前制備支架的常用材料包括膠原蛋白酶、聚乳酸、海藻酸鹽等材料。但這些生物材料都其相應的局限性，現(xiàn)實實驗條件下對這些生物材料進行可控研究難度較大。近年來，以多肽為基本組成結構單元，依靠納米多肽分子自組裝得到的納米組織工程學框架材料已成為組織工程領域新的研究熱點，這類納米多肽生物材料具有良好的生物兼容性、降解性，且最為突出的優(yōu)點是其具有生物活性。
　　隨著3D打印技術的興起和快速發(fā)展，3D打印已開始廣泛應用于醫(yī)學領域，

3、為精準化、個性化醫(yī)療提供條件，現(xiàn)階段對組織工程學高精密度打印也已進入深入的探索和研究。
　　以自組裝多肽納米溶液負載Ad-MSCs為“生物墨汁”利用3D生物打印技術打印出三維結構，通過體外培養(yǎng)3D打印模型內(nèi)的Ad-MSCs，并給予不同誘導分化條件，觀察其內(nèi)細胞的生長狀態(tài)及分化程度，研究功能性白組裝納米多肽作為負載Ad-MSCs的3D打印材料的可行性，探尋3D打印新的發(fā)展方向。
　　研究目的：
　　本實驗豈在研究以自組裝

4、納米多肽與人脂肪間充質(zhì)干細胞(Ad-MSCs)為“生物墨汁”，利用3D打印技術，制造組織工程學模型，觀察其內(nèi)細胞生長狀態(tài)及多向分化能力。希望借此找到新的組織工程學材料。
　　研究方法：
　　1.分離、培養(yǎng)原代Ad-MSCs，傳代至P2、P3后用于后續(xù)實驗;使用流式細胞儀對細胞進行細胞免疫表型鑒定并軟件分析;對細胞進行鬼筆環(huán)肽染色，觀察細胞微絲形態(tài);對細胞分別成內(nèi)皮、成骨、成脂誘導分化，并進行鑒定。
　　2.用10％蔗糖

5、-去離子水溶液溶解三種多肽（RADA16-Ⅰ、RGD、KLT），分別按所需濃度和體積比混合并原子力顯微鏡（Olympus公司）觀察;將混合溶液放入Transwell成膠，成膠后進行掃描電鏡觀察;將三種多肽與細胞混合并成膠后進行培養(yǎng)，并觀察多肽內(nèi)細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。
　　3.以自組裝納米多肽、Ad-MSCs混合溶液為“生物墨汁”利用3D生物打印技術打印組織工程學模型:打印后切片進行鬼筆環(huán)肽熒光染色并觀察;誘導3D模型中的Ad-MSC

6、s成骨和成脂分化，誘導完成后分別進行茜素紅S、油紅O染色，并與對比組進行染色比較。
　　研究結果：
　　1.倒置相差顯微鏡下可見Ad-MSCs為梭形，整體呈現(xiàn)出漩渦狀生長趨勢;流式細胞儀鑒定可見分離、培養(yǎng)的細胞CD166，CD90，CD29表達陽性，不表達CD31、CD34、CD45和HLA-DR，符合Ad-MSCs免疫表型。鬼筆環(huán)肽染色后可見細胞內(nèi)微絲結構;成骨、成脂誘導分化后可見細胞內(nèi)出現(xiàn)相關染色劑著色現(xiàn)象。
　　

7、2.原子力顯微鏡觀察納米多肽溶液，可見其內(nèi)有納米纖維結構;納米多肽水凝膠無色透明，含水量豐富;掃描電鏡觀察水凝膠，見其內(nèi)納米纖維結構并有孔隙;細胞與水凝膠混合成膠并培養(yǎng)后觀察可見其內(nèi)細胞排列緊密，生長狀態(tài)良好。
　　3.利用“生物墨汁”打印出組織工程模型，切片染色后可見其內(nèi)的細胞生長狀態(tài)良好，貼壁緊密。對模型內(nèi)的Ad-MSCs進行誘導分化，并分別對實驗組和對照組進行相關染色，茜素紅S染色可見成骨誘導實驗組中鈣結節(jié)形成，油紅O染色可