Gax和chemerin-CMKLR1干預Akt-mTOR和ERK1-2通路介導的脂肪與血管生成的實驗研究.pdf

1、傳統(tǒng)觀點認為脂肪組織是作為能量儲存器官，在能量吸收大于消耗時儲存能量，而在能量不足時提供能量。但現(xiàn)在越來越多的研究證實，脂肪組織也是一個重要的內分泌器官，它可以通過合成和分泌脂肪因子參與到很多生理和病理過程中，如可以影響其他器官組織的代謝，食欲，胰島素敏感性，免疫，和血管疾病等。這些脂肪因子包括脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α、IL-6、內脂素等。
　　Chemerin，作為一個新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，主要在胎盤、肝臟、白色脂肪組織中高表達。

2、它通過與它的G蛋白偶聯(lián)受體CMKLR1(又叫ChemR23)結合來參與到炎癥反應、脂質代謝、血管功能紊亂等生理或病理活動中。流行病學調查顯示，血漿chemerin水平與體重指數(shù)(BMI)及甘油三酯水平密切相關，且在高脂飲食小鼠體內，血漿chemerin表達水平顯著升高。在前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞轉化的過程中，也觀察到細胞chemerin含量上升。相反地，CMKLR1缺陷的小鼠則顯示出脂肪生成能力受損，且使用RNAi敲低chemerin

3、/CMKLR1的表達會抑制前體脂肪細胞向成鼠脂肪細胞的分化。這些結果顯示，chemerin在脂肪分化、生成中發(fā)揮重要的作用。還有一些研究顯示，chemerin也參與到血管功能調節(jié)中，體外血管生成試驗中，chemerin能夠顯著促進毛細血管樣結構形成，增加微血管長度與數(shù)量。但是，chemerin對于脂肪生成及血管形成的作用機制仍未被闡明。脂肪生成是一個很復雜的過程，它涉及到基因背景及環(huán)境因素，還有眾多的細胞因子、信號通路參與其中等。脂肪組

4、織的生長也需要血管來提供營養(yǎng)，且脂肪生成和血管生成是一個緊密聯(lián)系、相輔相成的過程。因此，找到一個合適的能夠且同時研究脂肪生成和血管生成聯(lián)系點的模型是很有必要的。將3T3-F442A細胞注射在裸鼠皮下，能夠長成一個成熟脂肪墊，這個脂肪墊在外觀上與正常脂肪細胞幾乎無差異，并且脂肪墊中充滿新生血管，因此，這個脂肪墊是一個理想的同時研究脂肪生成和血管生成的模型。
　　在真核生物中，針對轉錄水平的干預是有重大意義的。Gax，又名同型異源盒基

5、因，是一個轉錄抑制因子，主要在心血管系統(tǒng)中個體發(fā)育、器官形成、細胞生長、分化和遷移中起重要作用。以往有研究顯示Gax參與到血管生成和脂肪分化中。但Gax基因能否調節(jié)chemerin對于脂肪生成和血管生成的作用還未知。
　　綜上所述，我們提出這樣的假設，chemerin通過激活某種信號轉導網絡來促進脂肪生成和血管生成，而轉錄抑制因子Gax基因能夠在體外和體內模型中有效表達，并且能夠阻斷chemerin所介導的信號通路轉導及脂肪生成和

6、血管生成。
　　第一部分 體外試驗檢測Chemerin和Gax對于3T3-F442A前體脂肪細胞生物學功能影響的機制
　　方法
　　1.實驗分組:
　　(1)根據(jù)chemerin的濃度分組:為了檢驗不同濃度梯度下chemerin對于前體脂肪細胞生物學功能的影響，按照chemerin的濃度將前體脂肪細胞分為6個組:0ng/ml（空白對照組）組、20ng/ml組、40ng/ml組、60ng/ml組、80ng/ml組和

7、100ng/ml組。
　　(2)根據(jù)有無Akt通路抑制劑(LY294002)及chemerin分組:PBS組（空白對照組）、LY294002組、chemerin組和LY294002+chemerin組。
　　(3)根據(jù)有無ERK1/2通路抑制劑(PD98059)及chemerin分組:PBS組（空白對照組）、PD98059組、chemerin組和PD98059+chemerin組。
　　(4)按有無chemerin腺病

8、毒和（或）Gax腺病毒分組:Ad-GFP對照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad-Gax組和Ad-Gax組。
　　2.MTT法:檢測不同處理組的細胞增殖情況。
　　3.流式細胞術:檢測不同處理組的細胞周期分布情況。
　　4.油紅O染色:檢測不同處理組的前體脂肪細胞分化情況。
　　5.蛋白免疫印跡分析:檢測不同處理組的相關蛋白如:FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、Akt/m

9、TOR和ERK1/2通路的表達情況。
　　6.細胞免疫熒光染色:檢測TRITC標記的相關蛋白在細胞的表達情況。
　　結果:
　　1.Chemerin對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實，與空白對照組相比，各濃度的chemerin均能夠有效地促進前體脂肪細胞的增殖，且促進前體脂肪細胞增殖的能力隨著chemerin滴度的增加而逐漸增加。
　　2.LY294002對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實

10、，與空白對照組相比，LY294002（20um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細胞的增殖，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞增殖。
　　3.PD98059對于前體脂肪細胞增殖的影響:通過MTT實驗證實，與空白對照組相比，PD98059（40um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細胞的增殖，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞增殖。
　　4.LY294002對于前

11、體脂肪細胞分化的影響:通過油紅O實驗證實，與空白對照組相比，LY294002(20um/ml)能夠有效地抑制前體脂肪細胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin（100ng/ml）的促進前體脂肪細胞分化。
　　5.PD98059對于前體脂肪細胞分化的影響:通過油紅O實驗證實，與空白對照組相比，PD98059（20um/ml）能夠有效地抑制前體脂肪細胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin(100ng/ml)的促進前體脂肪細胞分化

12、。
　　6.重組腺病毒的轉染:經過72小時的轉染，幾乎所有的細胞都能夠高表達GFP，且細胞免疫熒光顯示Gax集中表達在胞核而chemerin主要表達在胞質。
　　7.Chemerin和Gax對于細胞周期和細胞增殖與凋亡的影響:
　　(1)Chemerin對于細胞周期和凋亡的影響:與Ad-GFP對照組相比，在Ad-chemerin組，G2/M期細胞比例增加、細胞凋亡減少。
　　(2)Gax基因對細胞周期和凋亡的影響

13、:與Ad-GFP對照組相比，在Ad-Gax組，GO/G1期細胞比例增加、G2/M期細胞比例降低、細胞凋亡增加。
　　(3)Gax對于chemerin所介導促進細胞周期和凋亡的影響:與Ad-chemerin組相比，在Ad-chemerin+Ad-Gax組，GO/G1期細胞比例增加、G2/M期細胞比例降低、細胞凋亡增加。
　　8.Chemerin和Gax對于細胞分化的影響:油紅O試驗顯示:與空白對照組相比，Gax基因能夠有效地抑

14、制前體脂肪細胞的分化，且能夠有效地抑制chemerin的促進前體脂肪細胞分化。
　　9.相關細胞因子及信號通路的表達情況:
　　(1)Wertemblot:chemerin組與空白對照組比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達增加，LY294002組與空白對照組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、p-Akt、p-mTOR、p-p7

15、0S6K和p-4EBP1的表達降低，PD98059組與空白對照組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、p-ERK1/2的表達降低，而LY294002+chemerin組和PD98059+chemerin組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對照組相比較無統(tǒng)計學差異;Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR

16、1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1和p-ERK1/2的表達增加，Ad-Gax組與Ad-GFP組相比較，F(xiàn)ABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP的表達降低，而Ad-Gax+Ad-chemerin組和Ad-GFP組的FABP4、VEGF、chemerin、CMKLR1、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1則與空白對照組相比

17、較無統(tǒng)計學差異。(2)細胞免疫熒光的統(tǒng)計學結果也與werstemblot相同。
　　結論:
　　1.Chemerin能夠通過Akt/mTOR和ERK1/2通路促進前體脂肪細胞的增殖和分化。
　　2.Chemerin能夠促進細胞周期進程，而Gax能夠促進細胞凋亡，抑制細胞周期且能夠削弱chemerin的促周期作用。
　　3.Gax能夠抑制chemerin的促進分化作用。
　　4.Gax能夠抑制chemerin

18、的促進Akt/mTOR和ERK1/2通路激活作用。
　　第二部分 體內試驗檢測Chemerin和Gax對于脂肪及血管生成的影響
　　方法:
　　(1)模型的建立:將2x107個3T3-F442A細胞注射到裸鼠背部皮下，分別在1周、4周、7周、10周時處死裸鼠，然后觀察不同時間段脂肪墊的生長情況。
　　(2)模型分組:將裸鼠隨機分為4個組:Ad-GFP對照組、Ad-chemerin組、Ad-chemerin+Ad

19、-Gax組和Ad-Gax組。將2x107個3T3-F442A與相應重組腺病毒毒液混合后注射到裸鼠背部皮下。
　　(3)動物活體成像儀檢測:成模第3天時，使用動物活體成像儀檢測GFP表達情況。
　　(4)顯微結構及免疫組化檢測:成模2周時，處死裸鼠。分別對不同處理組的脂肪墊進行顯微結構檢測。使用免疫組化對不同脂肪墊行FABP4、VEGF、CD31、p-ERK1/2、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1檢測

20、。
　　(5)蛋白免疫印跡分析:檢測不同處理組脂肪墊的磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達情況。
　　結果:
　　(1)模型的建立:H&E染色顯示:在成模1周時，注射的3T3-F442A細胞仍保持成纖維細胞形態(tài);在4周時，一些前體脂肪細胞已經轉化成脂肪細胞形態(tài);7周時，大多數(shù)前體脂肪細胞已經轉化成脂肪細胞形態(tài);10周時，幾乎全部前體脂肪細胞都轉化成脂肪細胞形態(tài)，并且與正常脂肪組織的形態(tài)分

21、辨不出來差別。
　　(2)腺病毒體內轉染效率:在成模第3天時，使用動物活體成像儀可以清晰地檢測到GFP熒光表達。
　　(3)H&E染色顯示:Ad-chemerin組的脂肪形態(tài)細胞數(shù)量較多且存在較多的血管，而Ad-Gax組的細胞壞死較多且?guī)缀跤^察不到血管的存在。
　　(4)免疫組化檢測:①相比較Ad-GFP對照組，在Ad-chemerin組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是增加的;②相比較A

22、d-GFP對照組，在Ad-Gax組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是降低的;③相比較Ad-Ad-chemerin+Ad-Gax組，在Ad-Gax組的脂肪墊中，VEGF、FABP4的表達及微血管密度(CD31)是降低的。④蛋白免疫印跡分析和免疫組化檢測均顯示:Ad-chemerin組與Ad-GFP組比較，磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達增加。Ad-Gax組與Ad-GFP組比

23、較，磷酸化ERK1/2、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1的表達降低。
　　結論:
　　(1)使用3T3-F442A細胞注射到裸鼠皮下可以成功構建脂肪墊模型，這個脂肪墊模型與正常脂肪組織幾乎無差別，且脂肪墊模型中充滿血管，這提供了一個能夠同時研究脂肪生成和血管生成的理想的模型。
　　(2)將腺病毒與3T3-F442A細胞混合后注入裸鼠皮下后，腺病毒在第3天時就可以被檢測到表達，且表達能夠至少穩(wěn)定存在2周。