9型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)心肌細(xì)胞ERK1-2通路表達(dá)活性的研究.pdf

1、目的：以重組9型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus serotyoe9，rAAV9）為載體介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，觀察是否能增強(qiáng)心肌細(xì)胞ERK1/2通路表達(dá)活性，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　方法：分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，用含不同啟動(dòng)子的rAAV9轉(zhuǎn)染分離所得心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀及Western blot測(cè)定各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，選擇適宜啟動(dòng)子，并檢測(cè) rAAV9的心肌

2、特異性轉(zhuǎn)染。rAAV9介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞ERK1/2通路相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，免疫熒光定位檢測(cè) ERK1/2通路相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)位激活。星胞菌素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，Hoechst33342染色從形態(tài)學(xué)上評(píng)價(jià)各組細(xì)胞凋亡狀況。
　　結(jié)果：（1）流式結(jié)果顯示CBA啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)的rAAV9在心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為（9

3、1.5±1.0）％和（73.2±1.3）%（P＜0.05），Western blot結(jié)果顯示rAAV9-CBA-eGFP組eGFP蛋白的表達(dá)明顯強(qiáng)于rAAV9-CMV-eGFP組。（2）倒置熒光顯微鏡及Western blot結(jié)果均顯示rAAV9-CBA-eGFP可特異性轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，eGFP的表達(dá)高峰在第5天。（3） Western blot結(jié)果顯示rAAV9-eGFP-CaMEK轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞可高效活化ERK1/2通路相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因

4、子的表達(dá)。免疫熒光定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rAAV9-eGFP-CaMEK轉(zhuǎn)染組，P-ERK1/2發(fā)生核轉(zhuǎn)位。（4）Western blot結(jié)果顯示，rAAV9介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕星胞菌素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并且這種抗凋亡作用有可能正是通過激活ERK1/2通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：CBA啟動(dòng)子介導(dǎo)的rAAV9載體可特異性且高效的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，在心肌細(xì)胞的表達(dá)高峰在第5天。rAAV9介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)心肌細(xì)胞 ERK1/