復(fù)合遞送基因修飾干細(xì)胞與藥物的新型凝膠埋植體系的構(gòu)建及其對脊髓損傷的治療研究.pdf

1、干細(xì)胞具有多向分化潛能和豐富的細(xì)胞功能，對干細(xì)胞的基因修飾和基于干細(xì)胞的神經(jīng)組織修復(fù)策略長期以來受到廣泛關(guān)注。其中，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如脊髓損傷(SCI)，其發(fā)生后呈現(xiàn)復(fù)雜的動態(tài)病程和病理狀況，加之中樞神經(jīng)組織自愈力低，對損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)不但需要進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的補充，還必須克服細(xì)胞外基質(zhì)缺失以及組織微環(huán)境炎癥反應(yīng)等多方面的不利因素。如何建立能夠在SCI發(fā)生后實現(xiàn)有效的神經(jīng)功能恢復(fù)的多功能復(fù)合療法，已經(jīng)成為科學(xué)研究及臨床治療中的熱點

2、和亟待解決的難點問題。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴針對嚴(yán)重SCI后的神經(jīng)組織修復(fù)這一難題，結(jié)合基因傳遞、干細(xì)胞療法及局部緩控釋遞藥手段，構(gòu)建新型的多功能復(fù)合埋植體系。研究建立腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，結(jié)合臨床治療脊髓損傷的抗炎藥物甲基潑尼松龍（甲潑尼龍，MP），進(jìn)行脊髓組織的聯(lián)合埋植治療。首先，實驗通過對MSC基因轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化和系統(tǒng)研究，制備BDNF基因修飾的MSC，另一方面，構(gòu)建甲潑尼

3、龍明膠微球(MPGM)緩釋制劑以克服MP全身用藥的系統(tǒng)毒副作用和脊髓組織利用率低的問題。同時，為實現(xiàn)干細(xì)胞與藥物制劑的脊髓局部埋植，本研究基于天然細(xì)胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸(HA)的交聯(lián)反應(yīng)和黏附肽的修飾建立三維凝膠埋植支架載體，利用該載體包載基因修飾的MSC和MPGM進(jìn)行SCI后的神經(jīng)組織修復(fù)，通過體內(nèi)外考察，對這一復(fù)合埋植體系的治療效果進(jìn)行評價，并對復(fù)合埋植體系內(nèi)各組分在神經(jīng)恢復(fù)中的功能及各組分的聯(lián)合作用方式進(jìn)行了探討。
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4、建立高效低毒的MSC基因轉(zhuǎn)染體系，對新型脂質(zhì)載體Screenfect A(SF)在MSC中的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行了優(yōu)化和系統(tǒng)研究?；赟F所優(yōu)化的MSC基因轉(zhuǎn)染體系可以實現(xiàn)較高的基因轉(zhuǎn)染效率，并同時保持MSC良好的細(xì)胞活性。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，SF在質(zhì)粒的細(xì)胞攝取和表達(dá)陽性率中的表現(xiàn)與LipofectamineTM2000(Lipo)相當(dāng)，但SF的轉(zhuǎn)染顯示了更高的細(xì)胞平均表達(dá)水平和MSC增殖活性，且血清對SF轉(zhuǎn)染MSC的效率及細(xì)胞活性的影響皆較小。

5、相比常用脂質(zhì)載體Lipo，基于SF的基因傳遞明顯減少質(zhì)粒用量，在對基因轉(zhuǎn)染效率及MSC細(xì)胞活性的兼顧中顯示明顯的優(yōu)勢。進(jìn)一步對SF所攜載質(zhì)粒的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運行為的考察發(fā)現(xiàn)，質(zhì)?？捎谵D(zhuǎn)染0.5h之內(nèi)開始入胞，順利進(jìn)行溶酶體逃逸，進(jìn)而于4h之內(nèi)逐漸進(jìn)入MSC細(xì)胞核。
　?、菫榱搜a充受損組織中缺失的細(xì)胞外基質(zhì)，避免所埋植MSC的流失和細(xì)胞死亡，并為受損組織提供支撐和橋接，本研究基于HA構(gòu)建三維凝膠支架埋植載體。研究通過對HA分子量和支架制備處

6、方的優(yōu)化篩選，獲得具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和一定力學(xué)強度的凝膠支架。為了提高支架的細(xì)胞相容性，促進(jìn)MSC在支架內(nèi)的黏附生長，研究引入源于層粘連蛋白鏈的多肽PPFLMLLKGSTR對凝膠支架進(jìn)行表面修飾。體外實驗結(jié)果顯示，黏附肽的修飾顯著提高了HA凝膠支架對MSC的細(xì)胞相容性，MSC可于肽修飾的支架中黏附生長并長期存活。實驗進(jìn)一步對埋植體系的體內(nèi)脊髓組織相容性及在體內(nèi)對MSC的支持作用進(jìn)行考察，將攜載MSC的支架埋植入脊髓組織，肽修飾的支架本

7、身即顯示了良好的組織橋接功能，同時可顯著提高M(jìn)SC在組織中的存活。通過對支架-細(xì)胞復(fù)合埋植及二者單獨埋植的研究分析發(fā)現(xiàn)，支架載體與干細(xì)胞在脊髓修復(fù)過程中具有明顯的協(xié)同作用:支架載體或MSC單獨埋植時作用微弱，而二者復(fù)合埋植后顯著提高了脊髓組織完整性，對大鼠運動功能恢復(fù)和組織神經(jīng)絲重建發(fā)揮了顯著的促進(jìn)作用。進(jìn)一步對組織內(nèi)繼發(fā)性損傷初期情況的考察初步揭示了復(fù)合埋植體系發(fā)揮顯著修復(fù)作用的可能原因，即干細(xì)胞與支架載體的埋植對炎癥細(xì)胞浸潤和膠質(zhì)疤

8、痕形成具有協(xié)同抑制作用。
　?、然趯χЪ茌d體體內(nèi)外相容性和與MSC之間協(xié)同作用的探討，本研究進(jìn)一步利用所構(gòu)建的支架載體攜載BDNF基因修飾的MSC進(jìn)行SCI后的神經(jīng)組織修復(fù)治療。體外實驗結(jié)果顯示，支架載體可支持基因修飾的MSC的長期存活及對所修飾基因的表達(dá)。體內(nèi)埋植后，對MSC的BDNF基因修飾及支架的攜載，都顯著增強了MSC細(xì)胞促進(jìn)脊髓修復(fù)的作用，埋植治療可明顯抑制膠質(zhì)疤痕形成，同時重建組織中的神經(jīng)絲，在橋接脊髓神經(jīng)組織的基礎(chǔ)

9、上，明顯改善脊髓組織內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。對于與支架共同埋植的MSC，BDNF的基因修飾可促進(jìn)MSC存活以及對神經(jīng)組織的修復(fù)作用，但對于缺少支架攜載的MSC，其BDNF基因修飾對細(xì)胞功能的增強效果則極其有限，進(jìn)一步證明支架載體對MSC脊髓埋植的重要作用。
　?、蔀閷⒖寡姿幬颩P進(jìn)行局部埋植以克服其全身用藥的毒副作用和利用率低的問題，本研究制備甲潑尼龍明膠微球緩釋制劑。分別對甲潑尼龍琥珀酸鈉明膠微球(MPSS-GM)、琥珀酸甲潑尼龍明膠微球

10、(MPH-GM)和甲潑尼龍明膠微球(MPGM)三種微球進(jìn)行藥物釋放性質(zhì)的研究，考察支架的肽修飾體系對微球最終包載藥量和釋藥性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過支架肽修飾體系的處理后，MPSS-GM只保留極少量藥物，MPH-GM保留部分藥物且釋放較快速，而MPGM保留了最多的藥物且釋藥時間最長。實驗建立MP的高效液相分析方法學(xué)，對MPGM釋藥性質(zhì)的進(jìn)一步研究顯示其可實現(xiàn)400小時以上的持續(xù)釋藥。
　?、蕿榱藢崿F(xiàn)MPGM在脊髓組織中的埋植，實驗

11、進(jìn)一步利用肽修飾支架包載MPGM。體外考察發(fā)現(xiàn)，包載MPGM的肽修飾支架仍具有藥物緩釋功能和良好的MSC細(xì)胞相容性。利用肽修飾的支架攜載MPGM和基因修飾MSC進(jìn)行聯(lián)合埋植，體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，MP和BDNF-MSC在脊髓組織中的聯(lián)合埋植可有效調(diào)節(jié)組織中炎癥反應(yīng)，埋植7天時對促炎因子的下調(diào)作用和抑炎因子的上調(diào)作用最為明顯，14天和28天時，聯(lián)合埋植仍顯示明顯的抑炎作用，并顯著促進(jìn)了脊髓組織再生。對包載空白GM的支架攜載BDNF-MSC進(jìn)行