固金消瘤湯治療Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者的臨床和實驗研究.pdf

1、目的:
　　觀察固金消瘤湯治療Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者的臨床療效，實驗研究固金消瘤湯的抑瘤功效及其作用機(jī)制，為固金消瘤湯的應(yīng)用提供臨床及實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.60例Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者，隨機(jī)分為中醫(yī)組、西醫(yī)組及中西醫(yī)結(jié)合組，每組各20例。中醫(yī)組予固金消瘤湯(Gujin Xiaoliu Tang，GJXLT)，西醫(yī)組予單純化療，中西醫(yī)結(jié)合組予固金消瘤湯聯(lián)合化療。觀察兩周期化療療程，每周期

2、化療前后記錄患者的中醫(yī)癥狀、血液生化、卡氏評分、腫瘤大小等情況，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　2.按標(biāo)準(zhǔn)方法制備GJXLT含藥血清、GJXLT含藥血清凍干粉及GJXLT凍干粉，分別作用于人肺腺癌A549細(xì)胞模型，MTT比色法檢測細(xì)胞生長抑制率，AnnexinⅤ-FITC/PI染色的熒光顯微鏡檢和流式細(xì)胞術(shù)研究GJXLT凍干粉對人A549細(xì)胞的促凋亡作用，Western blot免疫印跡法探討GJXLT對JAK2/STAT3信號通路STAT

3、3、p-STAT3及下游蛋白VEGF表達(dá)的影響。
　　3.腋窩皮下注射A549細(xì)胞懸液以建立BALB/c-nu小鼠移植瘤模型。稱取小鼠體質(zhì)量，隨機(jī)分為模型組、順鉑組、中藥低劑量組、中藥中劑量組及中藥高劑量組。小鼠每日給藥1次，連續(xù)給藥3周，給藥方案為:模型組予生理鹽水灌胃和腹腔注射;順鉑組予生理鹽水灌胃，同時予順鉑2 mg/(kg·d)腹腔注射;中藥低、中、高劑量組組分別予0.5g/mL、1g/mL、2g/mL GJXLT灌胃，并

4、予生理鹽水腹腔注射。給藥期間觀察小鼠生活狀況，定期測量小鼠移植瘤外觀體積。給藥結(jié)束后稱取小鼠體質(zhì)量，處死小鼠后剝離移植瘤，收集小鼠血液。游標(biāo)卡尺測量剝離瘤體積，DAB免疫組化法測定移植瘤Ki-67核蛋白表達(dá)，TUNEL熒光免疫組化法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況，全自動臨床生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)含量，全自動電化學(xué)發(fā)光自動儀檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量，三分類血細(xì)胞分析

5、儀檢測紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)及血小板(PLT)計數(shù)，鏡下觀察檢小鼠肝、腎組織形態(tài)學(xué)改變。
　　成果:
　　1.①臨床實驗完成病例數(shù)35例，中醫(yī)組（A組）8例，中西醫(yī)組12例（B組），西醫(yī)組15例（C組），各組病人年齡、性別及實驗前卡氏評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);各組病人病程、病理分型及臨床分期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②治療結(jié)束時，B組腫瘤穩(wěn)定例數(shù)高于A組與C組，與A組比較差異有

6、統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019）。③治療結(jié)束后，A組、B組卡氏評分有升高趨勢(P分別為0.7425、0.0947);C組治療后卡氏評分有降低趨勢(P=0.4025);治療結(jié)束后中西醫(yī)組卡氏評分優(yōu)于中醫(yī)組與西醫(yī)組，與西醫(yī)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.049）。④治療結(jié)束后，B組在咳嗽、氣急、胸痛癥狀的緩解方面比C組有更好的療效，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），三組患者在痰血、咯痰、發(fā)熱、食欲不振、舌質(zhì)舌苔、脈象的方面雖有一定程度的緩解，

7、但3組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。⑤治療結(jié)束后，A組、B組及C組Ⅲ、Ⅳ度血紅蛋白及血小板減少病例數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);A組Ⅲ、Ⅳ度白細(xì)胞減少病例數(shù)較C組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。
　　2.①GJXLT含藥血清作用于A549細(xì)胞48h后，整體抑制率為11.57％(P=0.0001＜0.01);與對應(yīng)濃度的空白血清比較，20％、30％含藥血清組A549細(xì)胞的抑制率分別為16.34％(P=-0.

8、0006＜0.01)與19.72％(P=0.0096＜0.01);②GJXLT含藥血清凍干粉作用于A549細(xì)胞72h后，整體抑制率為22.58％（P=0.0178＜0.01），與對應(yīng)濃度的空白血清凍干粉比較，6.25％、100％含藥血清凍干粉對A549細(xì)胞的抑制率分別為24.51％(P=0.0062＜0.01)與43.72％(P=0.0489＜0.01);③GJXLT凍干粉作用于A549細(xì)胞12h、24h及36h后，與溶劑對照組比較，除

9、12h及24h的GJXLT(8.88ug/ml)組外，各時間點各濃度GJXLT凍干粉均能抑制A549細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且抑制率具有時間和濃度依賴性;④倒置熒光顯微鏡下觀察，與溶劑對照組相比，GJXLT凍干粉作用A549細(xì)胞24h后，早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)越多，濃度越大，早期及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)越多;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，與溶劑對照組相比，早期凋亡率及晚期凋亡率均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.385; P=0.0156)，兩兩比較，GJXLT

10、高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);⑤Western blotting蛋白印跡法檢測結(jié)果表明，GJXLT凍干粉作用于A549細(xì)胞24h后，與溶劑對照組相比，GJXLT(100ug/mL)組P-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，余GJXLT濃度組P-STAT3蛋白表達(dá)有降低趨勢(P＞0.05)，呈劑量依賴性效應(yīng);與溶劑對照組組比較，GJXLT(100ug/mL)與GJXLT(50ug/mL) VEGF蛋白表

11、達(dá)明顯降低(P＜0.05)，GJXLT(25ug/mL)VEGF蛋白表達(dá)有降低趨勢，呈劑量依賴性效應(yīng)。各組STAT3總蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.①給藥1周后，模型組小鼠移植瘤體積隨時間呈指數(shù)式增長、曲線陡直，順鉑組與GJXLT低、中、高劑量組腫瘤生長相對緩慢，曲線較模型組低平;給藥結(jié)束時與模型組比較，順鉑組及GJXLT中、高劑量組小鼠移植瘤體積明顯較小(P＜0.05);與順鉑組比較，GJXLT中、高劑量組小鼠移

12、植瘤體積無明顯差異（P＞0.05）。②給藥結(jié)束后與模型組比較，順鉑組及GJXLT中、高劑量組剝離瘤體積明顯較小(P＜0.01);與順鉑組比較，GJXLT中、高劑量組剝離瘤體積無明顯差異（P＞0.05）;GJXLT中、高劑量組瘤體積抑制率分別為44.94％、50.87％，高于順鉑組的34.96％。③與空白對照組及順鉑組比較，GJXLT中、高劑量組剝離瘤組織Ki-67蛋白表達(dá)均較弱，陽性細(xì)胞率分別為(44.61±8.39)％及(29.94±

13、3.41)％，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);GJXLT低、中、高劑量組間兩兩比較，部分具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;④TUNEL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，鏡下觀察GJXLT組剝離瘤組織凋亡細(xì)胞比例較空白對照組及順鉑組高，且隨GJXLT劑量的升高，染為棕色的細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）比例隨之升高。⑤與模型組及順鉑組比較，GJXLT各劑量組裸鼠皮毛光澤，活動靈活，實驗結(jié)束時體質(zhì)增加，其中GJXLT高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比

14、較，順鉑組裸鼠皮毛欠光澤、反應(yīng)遲鈍、行動遲緩等毒副作用，實驗結(jié)束時體重明顯減輕（P＜0.05）。⑥與模型組比較，順鉑組白細(xì)胞計數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)，GJXLT各劑量組白細(xì)胞計數(shù)無顯著下降（P＞0.05）;與模型組比較，順鉑組及GJXLT高劑量組血小板計數(shù)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01);各組的紅細(xì)胞計數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。⑦與模型組比較，順鉑組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BU

15、N)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），GJXLT各劑量組ALT、AST、BUN及肌酐(Cr)水平無明顯差異（P＞0.05）;與模型組比較，GJXLT中、高劑量組CK-MB水平較低（P＜0.01）。⑧各組小鼠肝組織切片均未見炎性細(xì)胞浸潤及壞死的病理表現(xiàn)，肝細(xì)胞、肝血竇、門管區(qū)組織結(jié)構(gòu)大致正常。與模型組比較，順鉑組肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松淡染和氣球樣變，肝細(xì)胞輕度水腫，體積增大，排列稍顯紊亂，部分肝竇受壓和變窄

16、，有肝細(xì)胞輕度變性的表現(xiàn)。⑨各組小鼠腎組織切片均未見炎性細(xì)胞浸潤及壞死的病理表現(xiàn)，腎小球、腎小囊、腎小管等組織結(jié)構(gòu)基本正常。
　　結(jié)論:
　　1.固金消瘤湯(GJXLT)配合化療治療Ⅲ、Ⅳ期NSCLC脾虛痰濕型患者，可減少化療副反應(yīng)的發(fā)生，具有提高腫瘤客觀療效、減輕臨床癥狀及提高生存質(zhì)量的作用，臨床應(yīng)用安全，值得推廣。
　　2.GJXLT凍干粉、GJXLT含藥血清及其含藥血清凍干粉能抑制A549細(xì)胞生長，且具有濃度和時