噬菌體聚糖酶及其酶解產(chǎn)物的制備及性質(zhì)研究.pdf

1、本文從Klebsiella K13及其專一性侵染噬菌體P13出發(fā),對噬菌體P13的聚糖酶進行制備,以此為工具對Klebsiella K13的胞外多糖進行酶解得到酶解產(chǎn)物。并對噬菌體聚糖酶及其酶解產(chǎn)物的性質(zhì)進行研究。
　　 為提高Klebsiella K13胞外多糖產(chǎn)量,對其胞外多糖液體發(fā)酵的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。通過單因素試驗和正交試驗得出最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件如下:(1)最佳培養(yǎng)基組成為:10×鹽溶液(g/L):N

2、a2HPO4100,KH2PO430,NaCl10,MgSO4.7H2O2,CaCl2.2H2O0.01,FeSO4.7H2O0.01,K2SO410;葡萄糖30g/L,牛肉膏0.5g/L,蛋白胨0.5g/L,油酸1.5g/L。(2)最佳發(fā)酵參數(shù)為:初始pH7.0,溫度24℃,裝液量200ml/500mL,接種量10％,培養(yǎng)時間50h。以初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下對Klebsiella K13進行液體發(fā)酵,細菌胞外多

3、糖的產(chǎn)量達6.7 g/L,比條件優(yōu)化前的產(chǎn)量(2.64 g/L)增加了153％。
　　 通過對噬菌體P13侵染過程中菌液濃度、效價及酶活測定,確定噬菌體聚糖酶制備的最佳時間為噬菌體P13侵染后120min。利用丙酮提取法對噬菌體聚糖酶進行提取,并對最佳提取條件進行研究,發(fā)現(xiàn)添加1.5體積的預(yù)冷丙酮時提取效果最好。沉淀所得噬菌體聚糖酶使用100kD超濾離心管進行超濾離心后,采用Q-Sepharose FF柱層析進行初步純化。以提取

4、和純化過程中的酶活性及效價變化為指示,分析了每一個提取和純化步驟的效果,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過這些過程,噬菌體聚糖酶基本和雜蛋白分開。
　　 以高度專一性侵染Klebsiella K13的噬菌體所分泌的噬菌體聚糖酶為工具,對Klebsiella K13胞外多糖進行降解,得到的酶解產(chǎn)物經(jīng)Bio-Gel P4凝膠柱及Bio-Gel P6凝膠柱層析進行分離純化,得到P1,P2,P3三個低分子量的組分。通過氣相色譜分析對胞外多糖的單糖組分進行分析,發(fā)