順鉑和來曲唑?qū)Υ笫笞訉m內(nèi)膜異位癥的作用研究及臨床問題研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥形成“三步曲”：粘附、侵襲、血管形成，同時內(nèi)異癥的復發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點，與腫瘤極其相似，因此，內(nèi)異癥被認為是“良性疾病，惡性行為”，這更體現(xiàn)了它的類腫瘤性質(zhì)。在臨床工作中，內(nèi)異癥惡變的情況也并不少見，惡變的病理類型多為子宮內(nèi)膜樣癌和透明細胞癌，屬于子宮內(nèi)膜癌或者卵巢癌的范疇，在這兩類腫瘤的治療中，腹腔灌注化療占有重要位置，而在眾多的腹腔灌注化療方案中，順鉑是最常用而且療效最為明顯的一種。順鉑是細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，進入細

2、胞后，與DNA發(fā)生反應，形成DNA內(nèi)兩點或兩鏈的交叉連接，從而抑制DNA復制和轉(zhuǎn)錄，導致DNA斷裂和錯碼，抑制細胞有絲分裂，達到抗腫瘤作用。
　　芳香化酶是屬于細胞色素P450的一種復合酶，可以催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)變成雌酮和雌二醇。動物試驗研究表明，在內(nèi)異癥病灶中，芳香化酶相關蛋白表達水平增高。非甾體類芳香化酶抑制劑來曲唑被研究認為有抑制大鼠內(nèi)異癥病灶生長的作用。另有研究證明，通過持續(xù)的高劑量的來曲唑灌胃試驗，可以通過來曲唑的芳香

3、化酶抑制劑作用誘導大鼠體內(nèi)的高雄激素血癥并進而引起卵巢的多囊性改變和排卵障礙，并且動情周期失去周期性。而在大鼠內(nèi)異癥模型治療方案的探討中，人們主要關注來曲唑灌胃治療后的內(nèi)異癥病灶的變化，同時檢測其動情周期及卵巢內(nèi)分泌變化的研究未見報道。為彌補此類研究不足，本研究在研究來曲唑灌胃引起內(nèi)異癥病灶變化的同時檢測大鼠動情周期、卵巢內(nèi)分泌及排卵的變化情況，意在探討來曲唑?qū)?nèi)異癥病灶的作用機制，究竟是直接抑制病灶中芳香化酶的表達為主要作用，還是由于

4、來曲唑引起的大鼠內(nèi)分泌的變化導致的體內(nèi)低雌激素狀態(tài)為主要作用。
　　分子生物學、蛋白組學和動物模型的研究結果顯示，在動物模型以及人類患者內(nèi)異癥病灶中MMP-2、TIMP-2和TGFb2mRNA表達水平升高。另有研究發(fā)現(xiàn)IL-1b、TNF-a、VEGF、MCP-1和PEDF在內(nèi)異癥動物模型發(fā)病中也有重要作用。眾多的大鼠內(nèi)異癥模型研究，通過腹腔灌注治療藥物，并觀察病灶變化和檢測病灶中相關蛋白及因子的表達情況，來評價相應的藥物療效及探索

5、可能的治療方案。
　　基于以上理論，本研究課題設計思路為通過構建動物模型探討可能的新的內(nèi)異癥治療方法。本實驗選用的檢測因子指標為：VEGF、P450arom、TGF-β和MMP-2。芳香化酶P450arom蛋白的作用如上所述，血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF是內(nèi)異癥組織以及腫瘤組織在病灶生長以及轉(zhuǎn)移灶生長過程中必不可少的生長因子，它表達水平的高低直接決定了病灶的活性?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-2是其家族的重要成員，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物

6、(MMP/TIMP)是決定細胞外基質(zhì)ECM降解的主要酶系，是內(nèi)異癥病灶和腫瘤組織向周圍浸潤植入和轉(zhuǎn)移的關鍵因素。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β也是重要的生長因子，對內(nèi)異癥病灶和腫瘤的生長起關鍵作用。
　　本研究通過手術自體子宮內(nèi)膜移植法建造大鼠內(nèi)異癥模型，評價動物模型成功后，隨機分組進行試驗，通過病灶外觀觀察及病灶體積測量，組織切片病理觀察，以及異位內(nèi)膜的指標檢測，大鼠動情周期的動態(tài)觀察，大鼠卵巢的形態(tài)學、組織學及免疫學變化，同時檢測大鼠

7、性激素的改變，通過和來曲唑灌胃治療的比較，來探討腹腔灌注順鉑治療內(nèi)異癥的可能療效以及來曲唑治療內(nèi)異癥的更多機制，進一步從發(fā)病學及治療學研究內(nèi)異癥，為子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診斷和治療提供更多的實驗依據(jù)。本研究共分為四個部分，闡述如下。
　　目的：
　　第一部分：探討內(nèi)異癥大鼠模型的制作過程、技術要點及模型評價，為應用大鼠模型進行內(nèi)異癥藥物治療研究提供理論依據(jù)。
　　第二部分：研究應用順鉑腹腔灌注后，對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠

8、異位內(nèi)膜病灶的作用。
　　第三部分：研究在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型中，給予來曲唑灌胃處理后，大鼠卵巢形態(tài)、體內(nèi)性激素及卵巢功能的變化情況。
　　第四部分：研究在子宮內(nèi)膜異位癥模型中，腹腔灌注順鉑和來曲唑灌胃，對模型大鼠的異位內(nèi)膜病灶的作用，并且對二者的作用進行比較。
　　方法與結果：
　　第一部分：45只SPF(specific-pathogen free)級雌性SD(Spraue Dawley)大鼠。隨機分為空白

9、組、對照組、實驗組，各15只。內(nèi)異癥模型應用子宮內(nèi)膜自體移植法手術誘導，實驗組移植物剝除漿膜層，對照組不剝除漿膜層，空白組僅開腹探查?？瞻捉M和實驗組均每四日腹腔灌注生理鹽水1ml一次;對照組不給予灌注。記錄移植物的生長情況，測量并計算異位病灶的平均面積，及組織病理檢查，來評價模型成功與否。整個試驗過程，沒有死亡和感染病例;內(nèi)異癥病灶在所有30只模型大鼠成功形成。在應用試驗藥物之前，對照組和實驗組大鼠平均異位內(nèi)膜病灶面積沒有差別。在用藥過

10、程結束后，兩組平均面積均明顯增加，但是兩組用藥結束后的平均異位內(nèi)膜病灶面積沒有差別。組織病理學觀察，對照組和實驗組組織評分無明顯差別;兩組的異位組織病理評分與空白組大鼠在位內(nèi)膜組織病理評分相比，差別均無統(tǒng)計學意義。
　　第二部分：應用動物模型，36只SD大鼠在SPF設施內(nèi)飼養(yǎng)。應用大鼠子宮內(nèi)膜自體移植法誘導內(nèi)異癥模型。36只模型成功的大鼠隨機分為三組，分別為對照組、低劑量來曲唑組和高劑量來曲唑組，每組12只。對照組12只大鼠不進行

11、藥物干預;低劑量順鉑組每四天行順鉑腹腔灌注一次，劑量為35mg/m2;高劑量順鉑組每四天行順鉑腹腔灌注一次，劑量為70mg/m2;所有大鼠用藥療程共24天。測量記錄移植組織病灶的生長和病理評分。應用免疫組化、ELISA和Western blot法檢測病灶中vascular endothelial growth factor(VEGF)，aromatase P450(P450arom),transforming growth factor

12、 beta(TGF-β),和matrix metalloprotein(MMP)-2蛋白的表達情況。
　　結果顯示，在順鉑用藥療程結束后，兩順鉑組的平均病灶面積與對照組相比均明顯降低，兩組的病灶組織病理評分也都明顯的低于對照組。與對照組相比，蛋白標記物VEGF,P450arom，TGF-β和MMP-2的表達在兩個順鉑組均明顯降低。同時，高劑量順鉑組上述檢測指標的變化更加明顯，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。另外，在高劑量順鉑組，部分大鼠表

13、現(xiàn)出脫毛現(xiàn)象。
　　第三部分：一項前瞻性的動物模型研究。大鼠在SPF設施內(nèi)飼養(yǎng)。應用SD大鼠造模。內(nèi)異癥應用手術誘導法同上。對照組12只大鼠，每日應用1ml生理鹽水灌胃;低劑量來曲唑組12只大鼠，每日以0.5mg/kg來曲唑溶液灌胃;高劑量來曲唑組12只大鼠，每日以1mg/kg來曲唑溶液灌胃;每日行陰道涂片來觀察大鼠的動情周期變化。應用化學發(fā)光法測量大鼠血清中性激素FSH，LH，E2，T和P的濃度;應用大體外觀觀察對比和HE染色研

14、究大鼠內(nèi)異癥病灶和卵巢的組織病理變化。研究結果顯示，與對照組相比，兩來曲唑組大鼠在用藥14天失去了規(guī)律的動情周期變化，而且大鼠血清FSH，LH和T水平明顯升高，但是，來曲唑組的E2和P水平卻明顯低于對照組。兩來曲唑組的卵巢也呈現(xiàn)多囊性改變，排卵征象罕見。兩來曲唑組的大鼠異位內(nèi)膜病灶面積和組織病理評分也明顯的低于對照組。
　　第四部分：應用動物模型進行前瞻性研究。實驗動物在SPF設施內(nèi)飼養(yǎng)，應用SD大鼠制造動物模型。通過大鼠內(nèi)膜組織

15、自體移植來手術誘發(fā)內(nèi)異癥模型。將30只模型大鼠隨機分為三組，每組10只。第一組作為對照組不接受藥物處理;第二組大鼠每日給予來曲唑灌胃，劑量標準為0.2mg/kg;第三組大鼠每四天行腹腔灌注順鉑一次，劑量標準為35mg/m2;所有的大鼠處理過程持續(xù)24天。對內(nèi)膜移植物病灶的生長情況和組織學評分進行評價。應用免疫組化法和Western blotting法檢測病灶中與組織和血管形成相關蛋白的表達;大鼠血清中的性激素水平用ELISA法檢測。用藥

16、結束后，統(tǒng)計分析顯示，來曲唑組和順鉑組大鼠內(nèi)異癥病灶的生長和組織評分均明顯低于對照組;異位癥病灶中VEGF,P450arom，TGF-β和MMP-2蛋白的表達水平，在來曲唑組和順鉑組均明顯的低于對照組。另外，順鉑組中的P450arom蛋白水平明顯的低于來曲唑組;來曲唑組中的TGF-β和MMP-2蛋白水平明顯的低于順鉑組;來曲唑組大鼠血清中的T水平明顯高于順鉑組，而E2水平低于順鉑組。
　　結論：
　　1.大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模

17、型是一種易于建立和質(zhì)量可靠的動物模型，在建造過程中要注意一些技術要點，傳統(tǒng)的方法和改良的方法均可滿足試驗的要求，該模型對內(nèi)異癥的藥物治療研究有重要價值。
　　2.順鉑可以導致內(nèi)異癥大鼠模型異位內(nèi)膜病灶的萎縮退化，以及病灶中與組織增殖和血管生成相關的蛋白的表達水平降低，提示順鉑可能對內(nèi)異癥病人的臨床藥物治療有作用。
　　3.對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠應用來曲唑后，大鼠在卵巢和內(nèi)分泌方面表現(xiàn)出多囊卵巢綜合征的狀態(tài)，同時，也觀察到大