VSV G跨膜區(qū)在融合過程中的作用機制研究及亞硒酸鈉通過p70S6K-p53-ULK1通路誘導ROS上調(diào)抑制保護性自噬.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分
　　膜融合是一種重要的生命現(xiàn)象，參與多種細胞活動，包括細胞融合，囊泡轉運，細胞器的動態(tài)變化以及病毒感染。幾乎所有這些活動都是由一類特殊的膜蛋白——膜融合蛋白（也稱為融合原）所介導的。廣為熟知的融合蛋白是介導囊泡融合的SNARE復合物，在過去二十年中其作用機制已經(jīng)得到深入揭示。另一種重要的融合事件是包膜病毒的融合，這是由病毒融合蛋白所介導的。病毒融合蛋白定位在病毒的包膜上，控制病毒

2、感染的關鍵步驟——病毒包膜與宿主細胞膜的融合。
　　不同的融合蛋白誘導膜融合的物理過程基本相同，但具體機制卻大不相同。與SNARE復合物不同，病毒融合蛋白的構象復雜得多，這也決定了其融合機制更為復雜。在本研究中，關注水泡型口炎病毒的融合蛋白G蛋白的跨膜區(qū)在融合中的作用機制。構建了一套新的細胞-細胞融合系統(tǒng)，方便對VSV G介導的融合時間進行實時監(jiān)控以及定量分析。根據(jù)這套實驗系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)VSV G能夠在1-2min的時間內(nèi)迅速介導細胞

3、融合。為了研究跨膜區(qū)的功能，將VSV G的跨膜區(qū)替換成了其他融合蛋白的跨膜區(qū)。結果顯示跨膜區(qū)的替換會顯著降低VSV G的融合效率及其介導的慢病毒感染效率。由于VSV G的胞外結構域并未改變，僅是其跨膜區(qū)被替代，推測G蛋白仍能正常起始融合過程，但是融合可能會被阻斷在半融合狀態(tài)，而不能進一步完成完全融合。為了驗證假設，構建了另一套細胞-細胞融合實驗系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)的替換能夠將融合事件阻斷在半融合階段。最后，對VSV G跨膜區(qū)中影響融合的關鍵

4、氨基酸進行了篩選，并指出VSV G跨膜區(qū)在融合中的作用具有序列依賴性。
　　本研究中，發(fā)現(xiàn)VSV G的跨膜區(qū)對于其融合能力至關重要。跨膜區(qū)替換后融合過程被阻斷在了半融合階段。研究工作為以后融合機制的研究提供了一些新的研究策略，更重要的是為抗病毒預防和治療提供新的靶點。
　　第二部分
　　硒是人體所必需的微量元素，對身體健康、腫瘤的預防以及治療都有重要作用。大量證據(jù)表明，超營養(yǎng)劑量的硒能夠誘導包括前列腺癌，膀胱癌，甲狀腺

5、癌，食管肝癌，結腸癌，肺癌以及白血病等多種腫瘤細胞的凋亡。因此，研究亞硒酸鈉誘導白血病細胞凋亡的分子機制可以為含硒藥物的研發(fā)以及白血病的治療提供理論依據(jù)，并具有重要意義。
　　本課題以白血病NB4細胞為研究對象，研究亞硒酸鈉抑制NB4細胞保護性自噬和誘發(fā)細胞凋亡的分子機制。首先通過免疫熒光實驗以及電鏡觀察驗證了超營養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉處理NB4細胞后，自噬發(fā)生顯著下調(diào)，采用流式細胞術分析也證實的前面的結果，即亞硒酸鈉誘導細胞凋亡。在對

6、細胞內(nèi)活性氧水平進行檢測后，發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉處理后活性氧水平顯著上調(diào)，在活性氧清除劑處理后亞硒酸鈉對自噬的抑制作用得以逆轉。因此推測亞硒酸鈉對自噬的抑制作用與活性氧的有關。
　　進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉誘導的活性氧對自噬的抑制是由ULK1的下調(diào)介導的。通過ChIP實驗證明p-p53(Ser392)對ULK1進行轉錄調(diào)節(jié)。而在對p53的激酶進行篩查后發(fā)現(xiàn)p70S6K可以使p53Ser392位磷酸化進而調(diào)控ULK1表達，實現(xiàn)對自噬的控