丘腦網(wǎng)狀核內(nèi)部亞核團(tuán)在丙泊酚全麻過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)，全身麻醉藥丙泊酚于1989年正式上市，是具有里程碑意義的事件。自此丙泊酚憑借其起效快、無蓄積、恢復(fù)迅速等優(yōu)勢，在臨床上廣泛應(yīng)用。目前世界范圍內(nèi)每年有上千萬例外科手術(shù)在丙泊酚麻醉下進(jìn)行。丙泊酚已成為臨床應(yīng)用最為廣泛且不可或缺的全身靜脈麻醉藥物。然而和其他全麻藥一樣，丙泊酚的麻醉作用機(jī)制至今仍然不清楚。揭示全麻機(jī)理是神經(jīng)科學(xué)和麻醉學(xué)的夢想。2005年《Science》雜志主編Donald Ken

2、nedy將全麻機(jī)理列為學(xué)術(shù)界今后100年面臨的125個(gè)世紀(jì)難題之一[1]，攻破該堡壘亦將成為神經(jīng)科學(xué)和麻醉學(xué)領(lǐng)域里程碑式的飛躍。
　　全麻引起的可逆性意識消失作為大腦的特殊非生理狀態(tài)，與學(xué)習(xí)記憶、睡眠覺醒等大腦高級功能息息相關(guān)[2]。近年來越來越多的研究結(jié)果支持全麻藥物的作用機(jī)制并非以往認(rèn)為的——麻醉藥物對大腦整體的非特異性廣泛抑制，而是由各解剖位置、功能特點(diǎn)不同的神經(jīng)回路構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)協(xié)同參與麻醉藥物引起的大腦功能可逆性改變[3

3、-4]，即麻醉藥物通過作用于特定大腦區(qū)域，阻斷不同腦區(qū)的功能聯(lián)系，打破信息在高級中樞的正、負(fù)反饋平衡而發(fā)揮麻醉作用。Ying的研究提示丘腦網(wǎng)狀核（thalamic reticular nucleus，TRN）在丙泊酚的全麻機(jī)理中發(fā)揮了重要作用[5]。然而，丙泊酚是否以及如何作用于TRN并產(chǎn)生麻醉作用仍然不清楚。
　　TRN在大腦信息調(diào)控中的地位極其特殊。它由GABA能抑制性神經(jīng)元組成，調(diào)控丘腦-皮層環(huán)路，是網(wǎng)狀上行激動系統(tǒng)的一部分

4、。自2011年起，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道通過光遺傳、電生理等技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRN內(nèi)部存在不同的功能性子網(wǎng)，即TRN各個(gè)亞核團(tuán)的GABA能神經(jīng)元投射至丘腦及皮層的不同區(qū)域并發(fā)揮不同的生理作用[6]。由于TRN特殊的解剖位置、生理功能，并且和睡眠、覺醒、意識等大腦功能密切相關(guān)，啟發(fā)并促使我們探索它在麻醉這個(gè)無知覺、無意識、類似而有別于睡眠的特殊非生理狀態(tài)中所起的作用。本課題致力于探索TRN內(nèi)部亞核團(tuán)參與丙泊酚發(fā)揮麻醉作用的具體分子、細(xì)胞、網(wǎng)絡(luò)及行為機(jī)制，

5、為丙泊酚中樞麻醉的網(wǎng)絡(luò)學(xué)說及相關(guān)核團(tuán)定位提供新的依據(jù)和方向。
　　研究方法:
　　(1)使用鵝膏蕈氨酸分別對TRN各亞核團(tuán)進(jìn)行化學(xué)性毀損，檢測核團(tuán)毀損后大鼠對丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。
　　(2)利用即刻表達(dá)基因C-Fos和GAD-67免疫熒光共標(biāo)檢測TRN頭端(anteriorthalamic reticular nucleus,aTRN)和TRN尾端(posterior thalamic reticular n

6、ucleus,pTRN)的GABA能神經(jīng)元在清醒、丙泊酚麻醉、麻醉復(fù)蘇三個(gè)階段的功能狀態(tài)。
　　(3)通過分子免疫學(xué)方法驗(yàn)證丙泊酚的主要分子靶點(diǎn)GABAa受體β3亞基(GABAa receptor-β3 subunit，GABAaR-β3)在TRN各亞核團(tuán)中的存在和分布。
　　(4)在大鼠雙側(cè)aTRN處注射GABAa受體競爭性拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline，BIC)阻斷該受體，觀察其行為改變。待大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后，檢測

7、其對丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。
　　(5)制備針對GABAaR-β3的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）病毒，下調(diào)aTRN處GABAaR-β3的表達(dá)。免疫印跡法驗(yàn)證病毒干擾效果。待病毒起效后檢測大鼠對丙泊酚麻醉的反應(yīng)及敏感性改變。
　　研究結(jié)果:
　　(1) TRN各亞核團(tuán)被化學(xué)性毀損后，僅aTRN毀損組大鼠對丙泊酚的敏感性有明顯且持續(xù)的提高
　?、賏TRN毀損組大鼠相較于

8、對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后翻正反射消失(lost of righting reflex，LORR)的時(shí)間縮短并維持該狀態(tài)，即aTRN毀損組大鼠對丙泊酚的敏感性有明顯且持續(xù)的提高;aTRN毀損組大鼠對性質(zhì)不同的靜脈麻醉藥物（右美托咪定）的敏感性無明顯變化。
　?、趐TRN毀損組大鼠相較于對照組大鼠接受丙泊酚及右美托咪定靜脈泵注后LORR時(shí)間均無明顯變化。
　　(2) aTRN與pTRN的GABA能神經(jīng)元在清醒、麻醉和復(fù)蘇

9、三個(gè)階段呈現(xiàn)相反的功能狀態(tài)
　?、賏TRN的GABA能神經(jīng)元在清醒時(shí)活躍，而在丙泊酚麻醉后處于相對抑制狀態(tài)。
　　②pTRN的GABA能神經(jīng)元在丙泊酚麻醉后被明顯激活，而撤藥蘇醒后則處于相對抑制狀態(tài)。
　　(3) aTRN和pTRN均表達(dá)丙泊酚作用靶點(diǎn)GABAaR-β3且aTRN的表達(dá)量較pTRN更為豐富且密集
　?、俨捎妹庖哂≯E法驗(yàn)證抗GABAaR-β3抗體的特異性并使用該抗體檢測GABAaR-β3在aTRN、

10、pTRN、丘腦、海馬、皮層等腦組織的表達(dá)。結(jié)果顯示aTRN和pTRN區(qū)域均存在GABAaR-β3的蛋白表達(dá)。
　?、诿庖邿晒鈾z測結(jié)果顯示，GABAaR-β3在aTRN和pTRN均有一定分布;在相同視野下，GABAaR-β3在aTRN的表達(dá)量較pTRN更為豐富且密集。
　　(4)拮抗aTRN的GABAaR及下調(diào)aTRN處GABAaR-β3的表達(dá)使大鼠對丙泊酚敏感性下降
　　①大鼠雙側(cè)aTRN處注射GABAa受體拮抗劑BI

11、C阻斷該受體，動物即刻行為活躍，活動度明顯增加。
　?、贐IC注射組大鼠相較于對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時(shí)間明顯延長，即BIC注射組大鼠對丙泊酚敏感性下降。
　?、坩槍ABAaR-β3的siRNA病毒下調(diào)aTRN處該蛋白的表達(dá)，病毒干擾組大鼠較對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時(shí)間明顯延長，即病毒干擾組大鼠對丙泊酚敏感性下降。
　　結(jié)論:
　　aTRN的神經(jīng)元被化學(xué)性毀損后，動物對丙泊酚的敏

12、感性有顯著且持續(xù)的提高，而毀損其它部位則無類似變化。這提示aTRN極有可能參與丙泊酚對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮麻醉作用的過程。
　　C-Fos和GAD-67免疫熒光共標(biāo)發(fā)現(xiàn)aTRN與pTRN的GABA能神經(jīng)元在清醒、麻醉、復(fù)蘇三個(gè)階段顯示出相反的功能狀態(tài)，表明TRN各亞核團(tuán)在丙泊酚麻醉過程中發(fā)生了不同的功能變化。
　　BIC阻斷aTRN的GABAaR后動物即刻表現(xiàn)出亢奮狀態(tài)，即aTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性升高使動物呈現(xiàn)與麻醉相反

13、的行為學(xué)表現(xiàn)。BIC注射組相較于對照組，大鼠對丙泊酚敏感性下降。推測一方面aTRN處的GABAaR可能是丙泊酚的作用靶點(diǎn)，其被拮抗劑阻斷后使丙泊酚麻醉效能降低;另一方面aTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性升高可能對抗丙泊酚的麻醉作用。
　　免疫熒光結(jié)果顯示GABAaR-β3在aTRN處相較于pTRN有著更為豐富且密集的表達(dá)，在形態(tài)學(xué)角度支持aTRN作為丙泊酚麻醉神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)核團(tuán)的特殊性。
　　利用siRNA病毒下調(diào)GABAaR-

14、β3的表達(dá)，病毒干擾組大鼠相較于對照組大鼠對丙泊酚敏感性下降。進(jìn)一步證明aTRN處的GABAaR-β3對丙泊酚發(fā)揮麻醉作用至關(guān)重要。
　　綜上所述，我們推測丙泊酚極有可能通過與位于aTRN的GABAaR-β3結(jié)合后，抑制了該處GABA能神經(jīng)元（aTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性下降），從而使其下游、處于pTRN的GABA能神經(jīng)元去抑制。pTRN的GABA能神經(jīng)元興奮性升高，其軸突末梢發(fā)放更多的抑制性信號到丘腦和皮層，最終產(chǎn)生麻醉鎮(zhèn)靜