抗瘦素納米抗體的篩選及制備.pdf

1、瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關(guān)的多功能細(xì)胞因子，其在血液中的含量異常會(huì)導(dǎo)致肥胖、營(yíng)養(yǎng)不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過(guò)高的問(wèn)題，由此導(dǎo)致腎衰癥患者營(yíng)養(yǎng)不良、高血壓、胰島素抵抗等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，因此開(kāi)發(fā)特異性抗體實(shí)現(xiàn)瘦素水平的檢測(cè)與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優(yōu)良特點(diǎn)，成為該方面研究的最佳選擇。獲得足夠量的抗原是進(jìn)行抗體篩選的前提，由于血液

2、中瘦素含量較低，本論文首先進(jìn)行了瘦素的制備，然后進(jìn)行抗體的篩選。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴瘦素制備。根據(jù)人瘦素氨基酸序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET23a-leptin，優(yōu)化后的表達(dá)條件:活化的菌體以1％轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基后，恒溫?fù)u床37℃連續(xù)培養(yǎng)8h，期間不加入IPTG。瘦素以包涵體形式存在于大腸桿菌中，通過(guò)包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性、強(qiáng)陰離子交換色譜，最終獲得純度95％的重組人瘦素蛋白。⑵納米抗體篩選。通過(guò)五輪篩選，從瘦素免疫噬菌

3、體庫(kù)和非免疫庫(kù)中分別得到18種和5種特異性納米抗體序列，因有一序列重復(fù)，最終得到22種。經(jīng)Elisa方法檢測(cè)，選取其中結(jié)合活性較高的6種進(jìn)行后續(xù)表達(dá)純化。⑶納米抗體表達(dá)。利用PCR、雙酶切等手段構(gòu)建6種納米抗體的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli Shuffle T7進(jìn)行表達(dá)。除納米抗體A11表達(dá)量較低外，納米抗體A5、A12、A23、A33和B1表達(dá)量均可占總蛋白30％，且有可溶性表達(dá)。選擇A5、A33進(jìn)行表達(dá)純化，得到純度達(dá)90％的納