一種基于公共引物介導的白血病分子診斷技術研究.pdf

1、目的：
　　本課題利用公共引物介導的多重RT-PCR技術，以常見的白血病融合基因作為檢測靶標，目的在于研究建立新型的、系統(tǒng)的、提高PCR檢測通量的方法體系，研發(fā)適用于臨床的常見白血病融合基因檢測試劑盒。
　　方法：
　　本課題包括設計公共引物的設計與鑒定、重疊延伸法構建質粒模板、多重檢測體系的建立和臨床樣本檢測。
　?。?）用Primer Premier5.0軟件以非人基因組為模板進行基礎公共引物的設計；采用NC

2、BI網站Primer-blast功能進行公共引物與人基因組、人cDNA的特異性的理論比對；理論設計和篩選的公共引物分別與人基因組和人cDNA進行特異性溫度梯度PCR實驗驗證；將實驗驗證后的公共引物序列連接到人類一段GAPDH基因的兩端，插入到載體中構建質粒，利用含公共引物的質粒模板檢測公共引物擴增的敏感性；
　?。?）文獻檢索和數據庫篩選本課題多重體系的白血病融合基因檢測靶標；通過重疊延伸法將位于人cDNA上不同位置的兩個基因片段

3、通過PCR技術擴增獲得后連接在一起，插入載體構建包含檢測靶標融合基因的突變型質粒模板：BCR/ABL e1a2型和e13a2型、PML/RARαL型和S型、E2A/PBX1 I型、AML1/ETO、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL和CBFβ/MYH11 A型，另有一包含SIL/TAL1型融合基因的質粒模板通過直接合成法獲得；
　?。?）利用Primer Premier5.0設計檢測靶標基因特異性引物，將公共引物連接

4、在靶標特異引物的5’末端構成嵌合引物，利用NCBI網站Primer-blast功能進行嵌合引物的比對、修改和篩選，同時利用MFE2.0軟件進行體系多重引物的比對和修改；本課題針對常見的白血病融合基因設計了2個多重檢測體系，體系1針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1融合基因型；體系2在體系1基礎上添加檢測靶標E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1；通過構

5、建的包含白血病融合基因的突變型質粒模板進行體系特異性和敏感性檢測。將PCR擴增得到的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結果，進行多重體系的構建和優(yōu)化；
　?。?）收集正常人及白血病患者的外周血，根據TRIzol一步抽提法獲得人total RNA，6隨機引物和MMLV逆轉錄結果：本課題成功建立了篩選公共引物的方法體系；設計了三對公共引物，通過與人基因組、人cDNA的理論和PCR實驗比對，結果均無產物；其中一對公共引物

6、與包含公共引物序列的質粒載體進行敏感性PCR檢測時，檢測結果可達100個拷貝，選取該公共引物用于課題后期構建多重檢測體系。采用重疊延伸技術成功構建了十個包含白血病融合基因的突變型質粒模板；本課題設計的兩個針對常見白血病融合基因的多重檢測體系均可特異、敏感地檢測白血病融合基因。體系1可有效檢測針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1這4種融合基因的6個突變型質粒模板，即BCR/ABLe1a2型、PML/RA

7、RαS型、E2A/PBX1 I型、BCR/ABL e13a2型、PML/RARαL型和AML1/ETO型，其敏感性檢測結果依次為103，102，102，10，103和102拷貝。體系2針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα、E2A/PBX1、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1這9種融合基因的11個突變型檢測模板，即BCR/ABL e13a2型、TEL/AML1型、BC

8、R/ABLe1a2型、PML/RARα的L型、PML/RARαS型、AML1/ETO、E2A/PBX1 I型、E2A/HLF型、TEL/ABL型、CBFβ/MYH11 A型和SIL/TAL1型，其敏感性檢測結果依次為：102，102，103，103，103，103，103，103，103，104，104拷貝。運用這兩個多重體系對55例臨床標本進行檢測時，檢測結果均與醫(yī)院臨床診斷結果一致。
　　結論：
　　本課題構建的基于公共