制備液相色譜中整體蛋白高效快速分離新策略.pdf

1、隨著蛋白質(zhì)組學研究熱潮的到來，對于整體活性蛋白的分離和制備已成為影響蛋白質(zhì)組學研究向縱深發(fā)展的一大難題。一方面，為獲得更多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能信息，必需足夠量的高純度的活性蛋白；另一方面，應用蛋白質(zhì)組學研究成果開發(fā)與生產(chǎn)活性蛋白質(zhì)藥物急需高效的分離技術(shù)并降低生產(chǎn)成本。因此，研究制備規(guī)模下整體蛋白快速、高分辨分離的新策略是解決上述問題的關(guān)鍵。 本文首次提出了制備色譜中蛋白分離的五“S”策略，即使用短柱(Shortcolumn)裝填小

2、顆粒填料(Smallparticles)，在單位柱橫截面上(cross—Sectionalareaperunit)樣品較小的質(zhì)量過載(Smallsampleoverload)和適宜的低線流速(Suitablelowlinearvelocity)條件下進行活性蛋白高效快速的分離。 緒論。介紹了整體蛋白分離與制備的意義、分離技術(shù)和液相色譜分離介質(zhì)的研究進展；對色譜餅及其用于蛋白分離的理論、技術(shù)和應用的研究作了回顧；簡述了制備色譜的發(fā)

3、展及其與分析色譜的異同，引用文獻150篇。 實驗部分。包括了本文中所用的儀器、材料、實驗方法。 整體蛋白液相色譜分離的五“S”策略。全面比較了色譜柱和色譜餅分離整體蛋白時的分離度與峰容量；在分析規(guī)模下短色譜柱(色譜餅)和常規(guī)長色譜柱上這兩者相當，在制備規(guī)模下，同樣柱體積的色譜餅分離效果優(yōu)于色譜柱；裝填較細硅膠基質(zhì)填料的色譜餅在分離制備蛋白時能取代“軟”基質(zhì)的商品填料?；诖耸状翁岢隽酥苽渖V中蛋白快速、高分辨分離的五“S

4、”策略。 五“S”策略與熱力學因素。對生物大分子的色譜保留行為進行了研究，發(fā)現(xiàn)其在液相色譜分離過程中存在洗脫濃度窗口，用計量置換保留理論對此進行了解釋。通過對溶質(zhì)與固定相、流動相之間分子相互作用機理的探討，闡明了溶質(zhì)在色譜柱床上復雜的吸附、解吸附過程及其內(nèi)在特點。提出條件分離度、有效柱長比和單位橫截面積的樣品負載密度三個新概念，用來解釋超載狀態(tài)下蛋白在色譜柱床上具有優(yōu)異分離性能的原因。闡明了在此條件下提高蛋白分離度的有效途徑為增

5、加柱內(nèi)徑，降低柱床上樣品吸附層的厚度和樣品負載密度，同時為增大高流速下蛋白的產(chǎn)量應適當減小柱長；表明色譜餅是實現(xiàn)五“S”策略的首選柱技術(shù)。 五“S”策略與動力學的影響。分別考察了不同粒徑的色譜填料、填充方式和色譜柱特征對蛋白分離和譜帶擴展的影響。隨著填料粒徑的減小，蛋白的分離效果逐漸變好，色譜餅的幾何結(jié)構(gòu)使得其填料裝填密度要高于同體積的常規(guī)色譜柱，并因此減弱了蛋白的譜帶展寬。研究不同流速下蛋白的分離，以條件塔板高度對流速作圖，表

6、明色譜餅具有比色譜柱較小的最佳線流速和較寬的最佳流速范圍。提出以條件分離度與流速關(guān)系曲線確定和表征色譜分離的優(yōu)化條件。在色譜餅上對標準蛋白進行了高效快速分離的優(yōu)化，與文獻對比，色譜餅的樣品負載量大，分離效果好，質(zhì)量回收率和回收樣品濃度高。 五“S”策略的應用。用疏水色譜餅在6min內(nèi)實現(xiàn)了人血清樣品的一步快速分離制備。采用基于色譜餅的二維液相色譜成功實現(xiàn)了不同色譜模式之間緩沖溶液交換和人血清樣品在70min內(nèi)快速在線二維分離，在