骨硬化癥的臨床診斷及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　回顧性分析已納入本研究但尚未進(jìn)行基因診斷的9個(gè)骨硬化癥家系/（無(wú)家系）先證者的臨床資料；
　　對(duì)所有臨床診斷或者擬診常染色體顯性遺傳骨硬化癥的先證者進(jìn)行CLCN7基因篩查。對(duì)于CLCN7基因篩查后未找到突變位點(diǎn)的先證者，再逐一篩查其余能導(dǎo)致骨硬化癥的致病基因；對(duì)所有擬診骨硬化癥合并腎小管酸中毒的先證者進(jìn)行CAII基因篩查，確定其突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型。
　　對(duì)于臨床及基因均已確診的骨硬化癥先證者，對(duì)其相應(yīng)的突變

2、蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并嘗試探討其基因型和臨床表型的相關(guān)性。
　　方法：
　　收集自2008年起北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科臨床診斷或擬診骨硬化癥的9個(gè)家系/（無(wú)家系）先證者。
　　⑴分析9個(gè)骨硬化癥家系/（無(wú)家系）先證者的遺傳方式，臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征；
　?、茖?duì)9個(gè)骨硬化癥家系先證者/（無(wú)家系）先證者及其家系中的親屬進(jìn)行基因突變檢測(cè)；擬診常染色體顯性遺傳骨硬化癥的先證者針對(duì)CLCN7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序；擬診常染色體隱

3、性遺傳骨硬化癥合并腎小管酸中毒的先證者針對(duì)CAII基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，如發(fā)現(xiàn)新的錯(cuò)義突變則在50例無(wú)關(guān)健康人群中進(jìn)行驗(yàn)證；
　　⑶選取遺傳學(xué)已確診的錯(cuò)義突變的骨硬化癥先證者，應(yīng)用蛋白預(yù)測(cè)軟件Polyphen-2進(jìn)行突變體蛋白功能預(yù)測(cè)，并探討其基因型和臨床表型的相關(guān)性；
　?、葘?duì)于遺傳學(xué)確診剪切位點(diǎn)突變的骨硬化癥先證者，進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCR分析，明確該剪切位點(diǎn)對(duì)于蛋白功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1

4、.本研究確診了6例ADOⅡ患者和1例IARO患者，基因檢測(cè)證實(shí)了8個(gè)CLCN7基因突變，其中2個(gè)（c.856C>T，p.R286W；c.637C>T，P.L213F）為已報(bào)道的突變；5個(gè)（c.1039G>A，p.G347R；c.976A>G，p.R326G；c.869C>A，p.S290Y；c.1691T>C，p.L564P；c.671T>G，p.L224R）為新發(fā)的錯(cuò)義突變，1個(gè)（p.L224R， p.K691FS）剪切位點(diǎn)的新發(fā)突變

5、。該發(fā)現(xiàn)極大的擴(kuò)大了CLCN7基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)本研究總結(jié)并比較了CLCN7相關(guān)性的ADOⅡ和IARO患者分別在臨床特征和基因分型方面的異同點(diǎn)，有助于提高臨床醫(yī)師對(duì)該種疾病的認(rèn)識(shí)。
　　2.本研究報(bào)道了中國(guó)首例CAII相關(guān)性骨硬化癥，通過(guò)CAII基因檢測(cè)證實(shí)了CAII基因的2個(gè)新發(fā)突變（c.T381G，p.Y127X，c.350+2T>C，IVS3+2T>C），豐富了CAII基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)臨床觀察和分子生物學(xué)研究，提高了我

6、們對(duì)于這種疾病的認(rèn)識(shí)。然而，對(duì)于蛋白截短長(zhǎng)度更短的CAII基因的無(wú)義突變或剪切突變可引起的更為惡性的臨床表現(xiàn)，我們僅限于推測(cè)，還存在一定的局限性。因此，后續(xù)的研究應(yīng)致力于收集更多的CAII相關(guān)性骨硬化癥患者的臨床資料去明確其基因型和表型的關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　在本研究所納入臨床診斷或擬診骨硬化癥的患者中，最終確診了CLCN7相關(guān)性骨硬化癥ADOⅡ患者6例，CLCN7相關(guān)性骨硬化癥IARO患者1例以及ARO合并RTA患者2例

7、。共發(fā)現(xiàn)致病基因突變10個(gè)，其中CLCN7基因突變8個(gè)，包含兩個(gè)已報(bào)道的錯(cuò)義突變（p.R286W, p.L213F）；7個(gè)新發(fā)突變，其中6個(gè)為新發(fā)錯(cuò)義突變（p.L224R, p.S290Y, p.R326G, p.G347R, p.L564P）,一個(gè)新發(fā)剪切位點(diǎn)的突變（p.K691FS）。CAII基因突變2個(gè)，均為新發(fā)突變，分別為c.350+2T>C, IVS3+2T>C剪切位點(diǎn)突變和c.T381C p.Y127X無(wú)義突變。將所有已證實(shí)