IL-17通過(guò)抑制MDSCs凋亡影響小鼠抗瘤免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外觀察白細(xì)胞介素17（interleukin17，IL-17）對(duì)小鼠髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells）凋亡的影響，并探討ERK1/2分子在其中的作用；于Lewis荷瘤小鼠體內(nèi)研究IL-17是否通過(guò)調(diào)控MDSCs凋亡而影響腫瘤的生長(zhǎng)。
　　方法：
　　（1）通過(guò)皮下注射Lewis細(xì)胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型，采用免疫磁珠分選技術(shù)（MACS）分離脾臟MDSCs細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)IL

2、-17處理后，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測(cè)MDSCs凋亡情況，通過(guò)Western-blot技術(shù)檢測(cè)BCL-2的表達(dá)以及ERK1/2的磷酸化水平。
　　（2）在MDSCs培養(yǎng)體系中加入不同濃度ERK1/2分子磷酸化抑制劑（U0126）預(yù)處理，再經(jīng)IL-17作用，運(yùn)用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測(cè)MDSCs的凋亡情況并通過(guò)Western-blot技術(shù)檢測(cè)BCL-2的表達(dá)水平。
　?。?）在荷瘤小鼠體內(nèi)腹腔注射I

3、L-17，2.5μg/只/次，共三次。觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤重量和大??；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)核蛋白（Ki67）mRNA、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達(dá)情況。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的比例，免疫熒光技術(shù)（IF）檢測(cè)腫瘤組織中MDSCs的浸潤(rùn)情況。
　　（4）IL-17處理荷瘤小鼠后，通過(guò)MACS分選出MDSCs細(xì)胞。運(yùn)用Western-

4、blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平。常規(guī)培養(yǎng)后，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測(cè)MDSCs的凋亡情況，采用精氨酸酶（ARG-1）試劑盒檢測(cè)ARG-1活性，運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)BCL-2表達(dá)水平。
　　(5) IL-17處理荷瘤小鼠后，使用吉西他濱清除荷瘤小鼠體內(nèi)MDSCs，過(guò)繼轉(zhuǎn)移經(jīng)U0126處理后的MDSCs（簡(jiǎn)稱(chēng)過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型）。測(cè)量腫瘤體積、重量，采用qRT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中iNOS mR

5、NA表達(dá)水平，通過(guò)MACS分選MDSCs，常規(guī)培養(yǎng)，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測(cè)MDSCs凋亡情況，使用ARG-1試劑盒檢測(cè)ARG-1活性，運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)BCL-2表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1) IL-17處理MDSCs細(xì)胞24h，對(duì)照組活細(xì)胞比例為（45.33±1.556）％，IL-17處理組為（59.55±2.831）%（ P<0.001），晚期凋亡細(xì)胞比例對(duì)照組為（22.87±1.

6、349）%，IL-17處理組為（13.70±1.003）%（P<0.01）。Western-blot結(jié)果顯示：IL-17處理組ERK1/2分子磷酸化水平（P<0.001）、BCL-2表達(dá)水平都明顯上調(diào)（P<0.01）。
　　(2)在MDSCs培養(yǎng)體系中加入ERK1/2分子磷酸化抑制劑（U0126）預(yù)處
　　理，再加入IL-17處理。24h后，當(dāng)U0126濃度為7.5μM時(shí)，空白對(duì)照組活細(xì)胞比例為（39.08±2.718）%，

7、U0126處理組為（15.57±1.009）%（P<0.001），空白對(duì)照組晚期凋亡細(xì)胞比例為（8.007±1.777）%，U0126處理組為（26.95±1.179）%（P<0.01）。Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，U0126處理組抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)明顯減少。
　　(3)與PBS對(duì)照組相比， IL-17處理荷瘤小鼠后，腫瘤生長(zhǎng)速度加快（ P<0.01），腫瘤體積增加[PBS組為2.753±0.7803cm3， IL-1

8、7處理組為6.000±0.8653cm3）（P<0.05）]，腫瘤重量增加[PBS組為1.886±0.2020g，IL-17處理組為3.480±0.4586g（P<0.05）]，核蛋白Ki67mRNA表達(dá)增加（P<0.05）。FCM結(jié)果顯示：對(duì)照組脾臟中MDSCs數(shù)量為（2.187±0.2541）×107、比例為（13.40±0.3606）%， IL-17處理組數(shù)量為（3.967±0.1133）×107，比例為（24.43±1.1240

9、）%（P<0.001）。IF結(jié)果顯示腫瘤組織中MDSCs浸潤(rùn)數(shù)目增加， qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中iNOS mRNA表達(dá)增加（P<0.05）。
　　(4)與PBS對(duì)照組相比，Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-17處理后的荷瘤小鼠脾臟MDSCs中ERK1/2磷酸化水平、BCL-2表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05）；ARG-1活性明顯增強(qiáng)（P<0.05）。體外培養(yǎng)24h后， PBS對(duì)照組活細(xì)胞比例為（44.23±3.477）

10、%，IL-17處理組為（59.33±2.718）%（P<0.05）；PBS對(duì)照組晚期凋亡細(xì)胞比例為（33.28±4.104）%，IL-17處理組為（19.26±2.494）%（P<0.05）。
　　(5)與對(duì)照組相比，過(guò)繼轉(zhuǎn)移經(jīng)U0126處理的MDSCs后，脾臟和腫瘤組織中MDSCs分別減少了3.6%（P<0.05）、5.3%（P<0.01），腫瘤體積減小，腫瘤重量減輕（對(duì)照組為2.948±0.7537g，U0126處理組為0.7

11、830±0.1597g）（P<0.05），腫瘤組織中Ki67mRNA（P<0.01）、iNOSmRNA的相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05），脾臟分離出的MDSCs經(jīng)培養(yǎng)后，凋亡水平明顯增加，BCL-2表達(dá)量明顯減少（P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　（1） IL-17在體外能夠通過(guò)增強(qiáng)ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡
　?。?） IL-17能通過(guò)抑制MDSCs的凋亡和增強(qiáng)其免疫抑制活性促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。IL-