現(xiàn)場傳染病診斷關(guān)鍵技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、本研究針對現(xiàn)場傳染病診斷的需求，針對現(xiàn)場核酸提取、現(xiàn)場快速分子診斷方法的選取、現(xiàn)場快速檢測平臺(tái)的建立等關(guān)鍵技術(shù)展開研究，并將研究成果應(yīng)用在現(xiàn)場傳染病診斷上。
　　2000年Notomi等人建立了一種新穎的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP），這種新穎的擴(kuò)增方法需要至少4條引物，最多6條引物來特異性識(shí)別目標(biāo)片段的6個(gè)、7個(gè)或者8個(gè)獨(dú)立區(qū)域

2、，在DNA聚合酶的鏈置換作用下可以在很短的時(shí)間內(nèi)將靶序列擴(kuò)增出來，具有簡單、特異、高效、迅速的特點(diǎn)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，即白色的焦磷酸鎂沉淀，這一特性可以使LAMP反應(yīng)的過程中通過濁度的變化來直接判斷陰陽性結(jié)果。PCR需要兩條引物來特異性結(jié)合靶序列的兩個(gè)區(qū)間，而LAMP則是特異性的結(jié)合6至8個(gè)區(qū)間，所以相較于PCR來說具有很強(qiáng)特異性，敏感性比普通PCR相比可以提高10-100倍，與熒光定量PCR的敏感性相當(dāng)，但L

3、AMP擴(kuò)增的過程是在恒溫條件下進(jìn)行的，有熱穩(wěn)定的設(shè)備（比如恒溫水浴鍋、恒溫金屬浴等）就能滿足反應(yīng)要求，所以檢測成本就大大降低了。自從LAMP技術(shù)被報(bào)道后，在短短的十幾年的時(shí)間里，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的檢測，遺傳病的診斷，性別的早期判定等領(lǐng)域。
　　簡單快速的LAMP檢測方法需要簡單快速的核酸提取試劑盒與之相匹配，這樣就能充分發(fā)揮其優(yōu)勢。目前市場上的病毒核酸提取試劑盒主要有兩種，一是全自動(dòng)核酸提取儀，因其價(jià)格昂貴

4、，體積大，需要專業(yè)人士維護(hù)而主要應(yīng)用于大型醫(yī)院和國家大型實(shí)驗(yàn)室。二是普通核酸提取試劑盒，因其需要離心機(jī)、操作繁瑣、耗時(shí)長、專業(yè)化程度需求高而主要應(yīng)用于全國科研單位。而基層單位往往是傳染病暴發(fā)的起點(diǎn)，如果能就地快速進(jìn)行核酸診斷將對傳染病的防控起到積極的作用，而核酸提取是防控的第一步，根據(jù)現(xiàn)場或者基層的醫(yī)療條件，對核酸提取試劑盒的需求為快速、操作方便、使用簡單、無儀器化、專業(yè)化需求低。我們從現(xiàn)場核酸提取的需求出發(fā)研發(fā)了核酸提取試劑盒，本試劑

5、盒操作簡單，無需任何儀器，常溫保存，能有效防止交叉污染，專業(yè)化程度需求低，無需提前配液，無需加樣槍，提取純度高，15分鐘內(nèi)可以提取完成，適用于咽拭子、痰液、肛拭子等樣本病毒DNA/RNA的快速提取。
　　LAMP技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)片段擴(kuò)增1010倍，是PCR的100-1000倍，高效擴(kuò)增的同時(shí)也帶來了另一個(gè)大問題，氣溶膠的污染，這也是LAMP技術(shù)推廣遇到的最大的問題，氣溶膠的污染帶來假陽性，而且是非常嚴(yán)重的假陽性，這也是每一

6、個(gè)LAMP研究者遇到的非常棘手的一個(gè)問題，如何避免氣溶膠的污染也是大家共同致力解決的問題，實(shí)驗(yàn)分區(qū)是大家普遍采用的一個(gè)手段，但并不能從根本上解決問題，我們提出了一個(gè)從源頭控制擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，可以非常好的解決形成氣溶膠的問題，我們發(fā)明了一種封閉劑，本封閉劑在實(shí)驗(yàn)前加入，為固態(tài)，在反應(yīng)過程中為液態(tài)，可以很好的防止氣溶膠的形成，在反應(yīng)完成后又變?yōu)楣虘B(tài)，將擴(kuò)增產(chǎn)物完全封閉于管底，這樣就杜絕了擴(kuò)增產(chǎn)物揮發(fā)形成氣溶膠而形成假陽性，可以很好的解決因?yàn)?/p>

7、擴(kuò)增產(chǎn)物而帶來的假陽性。
　　目前有以下幾種方式判定LAMP反應(yīng)的結(jié)果:電泳、SYBR GreenⅠ染色、沉淀法、濁度法、鈣黃綠素染色、羥基萘酚藍(lán)染色(HNB)等，這些方法有一個(gè)共同點(diǎn):均是通過間接的方法來判定LAMP結(jié)果，無法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接的判定，如果產(chǎn)生了非特異擴(kuò)增，那么這些檢測方法均無法判斷，這也是LAMP技術(shù)遭遇的另一個(gè)大的問題，如何對擴(kuò)增產(chǎn)物直接檢測也成了LAMP技術(shù)的難點(diǎn)，我們從TaqMan探針熒光定量PCR技術(shù)得

8、到啟示，將TaqMan探針引入到LAMP技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)了對擴(kuò)增產(chǎn)物的直接檢測，也就從根本上解決了非特異擴(kuò)增的問題?；赥aqMan探針的LAMP法具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。
　　LAMP法面臨的另一個(gè)大的問題就是能否實(shí)現(xiàn)絕對定量，臨床上的一些病毒檢測要求絕對定量，LAMP法將來要走向臨床應(yīng)用，就必須克服這一問題，因?yàn)長AMP擴(kuò)增的過程非常復(fù)雜，產(chǎn)物片段大小不一，至今也沒有一個(gè)完整的數(shù)學(xué)模型，也就沒有一個(gè)數(shù)學(xué)推導(dǎo)公式來支持LAM

9、P的定量應(yīng)用，我們在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對于一些一定濃度的模板，LAMP的重現(xiàn)性非常好，而對于另外一些濃度的模板，則其的重現(xiàn)性變的不規(guī)律，總結(jié)起來就是，在105拷貝濃度以上時(shí)LAMP可以實(shí)現(xiàn)絕對定量，R2在0.99以上，而在105拷貝濃度以下時(shí)，則無法實(shí)現(xiàn)絕對定量，之所以有如此的結(jié)果，我們推測與LAMP復(fù)雜的反應(yīng)原理有關(guān)，模板濃度越低發(fā)生反應(yīng)的隨機(jī)性就變大，從而導(dǎo)致低濃度模板重現(xiàn)性降低。
　　在解決了樣本前處理，LAMP易污染假陽性高的問題

10、，非特異擴(kuò)增的問題，定量的問題后，我們建立了基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法快速檢測技術(shù)平臺(tái)，主要致力于開發(fā)臨床常見病原微生物快速檢測試劑盒，以及處置常發(fā)、新發(fā)、突發(fā)傳染病疫情。在平臺(tái)的基礎(chǔ)上我們開發(fā)了一系列快速檢測試劑盒，主要包括腹瀉相關(guān)的病原菌檢測試劑盒。
　　近年來新發(fā)、突發(fā)傳染病逐漸增多，2003年，SARS病毒;2009年，新的型甲型H1N1流感病毒;2010年，“超級細(xì)菌”NDM-1;2011年，新型腸出血性大腸桿菌造成的“毒黃瓜

11、”事件;2012年，55型腺病毒;2013年，人感染H7N9禽流感病毒等，簡單、快速、靈敏的檢測方法對于控制疫情蔓延會(huì)起到很好的作用，從而早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，我們利用已經(jīng)建立的基于LAMP技術(shù)的恒溫快速檢測技術(shù)平臺(tái)，研發(fā)了“超級細(xì)菌”耐藥基因NDM-1快速檢測試劑盒，腺病毒55型14型7型快速檢測試劑盒，人感染H7N9禽流感病毒快速檢測試劑盒，為應(yīng)對大規(guī)模疫情的爆發(fā)做好了物資儲(chǔ)備和技術(shù)儲(chǔ)備。
　　本研究致力于現(xiàn)場傳染病診斷關(guān)鍵