煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠AMPK-SIRT1通路的影響.pdf

1、目的：
　　多發(fā)性硬化（Multiple Sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)慢性炎癥性脫髓鞘為病變特點(diǎn)的自身免疫性疾病，是導(dǎo)致青年人致殘的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病因。雖然MS的病因目前尚未完全明確，但是普遍認(rèn)為MS是由遺傳和環(huán)境因素下誘導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)所導(dǎo)致的。MS的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但是起關(guān)鍵作用的是對(duì)髓鞘成分的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫炎癥損傷。實(shí)驗(yàn)

2、性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是被世界廣泛認(rèn)可的研究MS的動(dòng)物模型。近期研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用。SIRT1為NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一。AMPK是調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵酶，活化后的形式為p-AMPK,并且具有SIRT1依賴的抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)以NA

3、D+作為干預(yù)藥物，觀察正常對(duì)照組（Control組）、EAE組、NAD+治療組小鼠的臨床癥狀、病理結(jié)果以及SIRT1、AMPK、p-AMPK的表達(dá)變化，探索NAD+對(duì)EAE發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1將24只雌性C57BL/6小鼠（周齡8-10周、體重18g-20g）隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control組）、EAE模型組、NAD+治療組，每組8只。以MOG35-55作為抗原，輔以結(jié)核菌素H37Ra、完全弗式佐劑

4、、百日咳毒素建立EAE動(dòng)物模型。自免疫第1天起（免疫當(dāng)天為第0天），NAD+組小鼠每天腹腔注射NAD+250mg/Kg，Control組及EAE組小鼠每日腹腔注射等量的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），同時(shí)，每天用Weaver法對(duì)小鼠進(jìn)行兩次神經(jīng)功能評(píng)分，從免疫后第1天至30天，觀察小鼠發(fā)病情況及病程。
　　2將24只雌性C57BL/6小鼠（周齡在8-10周、體重18g-20g）隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control組）、EAE模型組、N

5、AD+治療組，每組8只。以MOG35-55作為抗原建立EAE動(dòng)物模型。自免疫第1天起（免疫當(dāng)天為第0天），NAD+組小鼠每天腹腔注射NAD+250mg/Kg，Control組及EAE組小鼠每日腹腔注射等量的PBS，同時(shí)，每天對(duì)小鼠進(jìn)行兩次神經(jīng)功能評(píng)分。于小鼠發(fā)病高峰期（免疫后第25天）留取標(biāo)本，從Control組、EAE組、NAD+組各取3只小鼠，行灌注取材，留取脊髓腰膨大組織，進(jìn)行HE染色，觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度；每組中另外5只小鼠，行

6、新鮮取材，留取脾和脊髓組織，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白的表達(dá)情況。
　　3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。發(fā)病率以百分比表示，用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床神經(jīng)功能評(píng)分用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組計(jì)量資料均數(shù)的比較：多樣本之間比較滿足正態(tài)性、方差齊采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的

7、方差分析（ONE-WAY-ANOVA），組間比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)或方差不齊采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1各組小鼠病程比較：正常對(duì)照組小鼠未發(fā)?。缓虴AE組相比，NAD+組小鼠的發(fā)病率顯著降低、發(fā)病時(shí)間被推遲、神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。
　　2 HE染色：在發(fā)病高峰期（免疫后第25天），與正常對(duì)照組相比， EAE組、NAD+組小鼠脊髓腰膨大

8、組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯增多（P＜0.05）；NAD+組與EAE組相比，小鼠脊髓腰膨大組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減少（P＜0.05）。
　　3 Western Blot（脊髓）：在發(fā)病高峰期（免疫后第25天），EAE組小鼠較空白對(duì)照組相比，SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平下降（P＜0.05）；NAD+組小鼠較EAE組相比，SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；空白對(duì)照組、EAE組、NAD+組相比，

9、AMPK蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　4 Western Blot（脾）：在發(fā)病高峰期（免疫后第25天），EAE組小鼠較空白對(duì)照組相比，SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平下降（P＜0.05）；NAD+組小鼠較EAE組相比，SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；空白對(duì)照組、EAE組、NAD+組相比，AMPK蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 NA