發(fā)散式?jīng)_擊波促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過應(yīng)用低能量發(fā)散式?jīng)_擊波(rESW)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)進(jìn)行直接刺激，觀察發(fā)散式?jīng)_擊波對(duì)BMSC增殖特性的影響。本研究從BMSC對(duì)沖擊波刺激的反應(yīng)出發(fā)，探求發(fā)散式?jīng)_擊波促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的理論基礎(chǔ)和作用機(jī)制。
　　方法:在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，采用差速離心法和懸浮貼壁法從2～3月齡的新西蘭白兔的脛骨骨髓中培養(yǎng)原代BMSC，培養(yǎng)至P4～P6代。分別從形態(tài)學(xué)、表面分子和分化能力（成脂、成骨）等方面對(duì)BMSC進(jìn)行鑒定。用不

2、同劑量的發(fā)散式?jīng)_擊波對(duì)懸浮的BMSC進(jìn)行直接刺激，根據(jù)沖擊波劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組，分為0bar/1 bar/2 bar/3 bar四組(Bar為沖擊波壓力單位)。對(duì)沖擊波刺激組與對(duì)照組的BMSC分別進(jìn)行CCK-8檢測(cè)和CFU-F檢測(cè)比較其增殖活性，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，我們使用與之前實(shí)驗(yàn)等月齡的新西蘭白兔制作膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，將每只兔子的左側(cè)膝關(guān)節(jié)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)膝關(guān)節(jié)設(shè)為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組采用微骨折加2 b

3、ar沖擊波進(jìn)行干預(yù)，而對(duì)照組只采用微骨折術(shù)。手術(shù)后24小時(shí)將骨髓等量沖出進(jìn)行體外CFU-F實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比BMSC增殖聚集情況。在對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)時(shí)，使用SPSS16.0軟件并使用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析。
　　結(jié)果:通過骨髓分離技術(shù)我們可以獲得原代BMSC，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，類似成纖維細(xì)胞樣聚集分布。在表面分子分析中，BMSC缺乏典型的造血細(xì)胞抗原CD45分子、CD14分子，也不表達(dá)CD79α

4、和CD90，高表達(dá)CD45和CD81。在誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，BMSC可以被成功誘導(dǎo)為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，通過相應(yīng)的染色得到證實(shí)，并檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。經(jīng)不同的沖擊波進(jìn)行刺激后，BMSC表現(xiàn)出不同的增殖特性。無論是CCK-8檢測(cè)還是CFU-F檢測(cè)，沖擊波刺激組都明顯優(yōu)于對(duì)照組，并且2Bar時(shí)其效應(yīng)最強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行CFU-F檢測(cè)中，對(duì)術(shù)后24小時(shí)分離的MSC培養(yǎng)，并于第8天、11天、15天進(jìn)行CFU-F檢測(cè)，結(jié)果顯

5、示實(shí)驗(yàn)組增殖活性均優(yōu)于對(duì)照組，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.發(fā)現(xiàn)兔BMSC在表面分子檢測(cè)中CD90為陰性，這是與以往文獻(xiàn)中的報(bào)道是不同的。
　　2.發(fā)散式?jīng)_擊波體外刺激BMSC具有促進(jìn)其增殖和聚集作用，在沖擊波劑量為2bar時(shí)其促增值作用最強(qiáng)。
　　3.發(fā)散式?jīng)_擊波對(duì)BMSC的作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，其對(duì)于沖擊波的軟骨修復(fù)劑量具有指導(dǎo)作用。
　　4.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用微骨折術(shù)配合沖擊波進(jìn)行軟骨缺損