體外沖擊波對成人骨髓間充質(zhì)干細胞中成骨活性因子及MAPK信號通路的影響.pdf

1、目的：在成功體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)的基礎(chǔ)上，研究體外沖擊波(ESW)干預(yù)對hMSCs增殖分化及成骨活性因子和酶聯(lián)信號分子表達的影響，探討ESW促進成骨過程中MAPK酶偶聯(lián)信號通路的狀態(tài)，為揭示ESWT治療成骨障礙性疾病的機理提供理論依據(jù)。 方法：自早期成人股骨頭壞死(ANFH)患者髂骨行骨髓穿刺抽取骨髓，采用密度梯度離心法提取hMSCs；經(jīng)體外培養(yǎng)成功后，應(yīng)用MTT法測定增殖活力，以確定ESW干預(yù)的合適劑量

2、；施加ESW干預(yù)后，分別利用倒置相差顯微鏡、HE染色隔代(P1-P11)觀察骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、貼壁率和倍增時間等變化，應(yīng)用酶細胞化學(xué)、免疫細胞化學(xué)等方法檢測堿性磷酸酶含量、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-I)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGFβ1)表達，以及磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(pERK1/2)水平；使用PD98059阻斷其上游激酶MEK，觀察干預(yù)組pERK1/2及TGFβ1表達變化。對上述各部分實驗數(shù)據(jù)采用相應(yīng)的方差分析、配對t檢驗、

3、X2檢驗和相關(guān)分析，設(shè)定P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果：1體外沖擊波對骨髓間充質(zhì)干細胞的影響顯著：3kY即可以促進hMSCs的生長，5kV的ESW的促進增殖作用最強(P＜0.01)。高于7kY的ESW干預(yù)將抑制hMSCs貼壁、存活和增殖，生長峰值低于對照組。ESW干預(yù)體外培養(yǎng)hMSCs的最佳能量為5kV(100次)。 2原代hMSCs細胞呈圓或扁圓形，48h內(nèi)陸續(xù)沉底貼壁，7～9d自細胞兩極伸出足狀的突起，呈短梭形或

4、多角形，胞體透亮，折光性好；細胞多至瓶底的80％即可消化傳代。 3傳代細胞經(jīng)HE染色，胞漿紅染，核呈深藍色，核仁明顯。ESW干預(yù)后的P1代hMSCs增殖分裂加快，胞漿豐富，胞核較大，核仁2～3個；P3-P5代hMSCs核分裂相多，核漿比值大，增殖高峰提前，細胞簇集融合，呈放射狀擴展；P7-P9代細胞體積增大明顯，3～5d即呈條帶狀交錯成片，基質(zhì)堆積成束，方向性明顯。干預(yù)后的P11代hMSCs仍有核分裂細胞呈對稱分裂，表現(xiàn)出定向成

5、骨分化的潛能；而對照組為不對稱分裂和多種分裂方式，存在多向分化的可能。 4ESW干預(yù)后的P5代hMSCs貼壁率為61.54％，明顯高于對照組(P＜0.05)；隨后兩組細胞的貼壁率差異逐漸加大。細胞倍增時間的變化與貼壁率并不同步：P3代干預(yù)組hMSCs提前進入對數(shù)生長期，倍增時間(Td)較對照組縮短1.72d；P5代干預(yù)組Td短于3d，細胞增殖能力最強；隨后細胞成骨分化活躍，以膠原合成為主，核漿比驟減，P7代干預(yù)組Td短于延長至4

6、.45d。與對照組相比，ESW干預(yù)明顯縮短了hMSCs的倍增時間(P＜0.05)。 5對照組堿性磷酸酶(ALP)曲線近似呈S型，有明顯的潛伏期(P0-P3)、指數(shù)生長期(P3-P7)和平頂期(P7之后)。ESW干預(yù)明顯縮短了hMSCs生長潛伏期，1周后ALP含量即明顯上升約14.2KU，增殖高峰提前在P5代出現(xiàn)(38.7KU)；干預(yù)組ALP總體水平明顯高于對照組(P＜0.05)。 6ESW干預(yù)后的P3代hMSCs胞漿及胞

7、核中出現(xiàn)大量黃色-棕黃色顆粒，IGF-Ⅰ陽性率為42.3％，而對照組無明顯著色；P7代干預(yù)組細胞呈強陽性，陽性率達87.9％，對照組開始出現(xiàn)IGF-Ⅰ染色明顯陽性的細胞，較干預(yù)組晚4代，約25d。兩組間差異顯著(P＜0.01)。骨髓間充質(zhì)干細胞中TGF-β1出現(xiàn)較晚；ESW干預(yù)組P5代僅見個別細胞呈弱陽性表達，P7代hMSCs胞漿可見均勻、淡染黃色顆粒，P9代TGF-β1染色陽性率為72.2％，個別細胞漿內(nèi)尚見深染的棕褐色顆粒；隨后陽性

8、率開始下降。對照組始終沒有出現(xiàn)明顯的陽性表達，兩組間差異顯著(P＜0.01)。TGF-β1陽性表達較IGF-Ⅰ晚6代，約40d，高峰持續(xù)時間短，僅在P9代干預(yù)組細胞。 7ESW干預(yù)后pERK1/2與TGF-β1的表達并不同步：P3代hMSCs胞漿內(nèi)即出現(xiàn)黃染顆粒，pERK1/2弱陽性；對照組僅P9代個別hMSCs陽性(P＜0.01)。干預(yù)組P9代hMSCs中pERK1/2活躍，強陽性表達與TGF-β1高峰同代出現(xiàn)；經(jīng)PD9805

9、9阻斷其上游激酶MEK后，pERK1/2表達顯著減弱(P＜0.01)，而TGF-β1染色仍呈均勻陽性(P＞0.05)。 結(jié)論：5kV(100次)的ESW是體外干預(yù)hMSCs試驗的最佳能量；ESW干預(yù)能夠提高hMSCs的貼壁、增殖及成骨活性，不同程度的促進了成骨活性因子的生成；ESW的骨科生物學(xué)作用可能是通過MAPK酶偶聯(lián)信號通路實現(xiàn)的，TGF-β1在hMSCs增殖晚期參與了ESW對ERK激酶的激活；這一過程應(yīng)該還有其它成骨活性因