雌激素受體-α在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)成骨分化影響的研究.pdf

1、雌激素和機(jī)械力都是調(diào)控骨改建的重要條件。由于絕經(jīng)期婦女雌激素缺乏，具有骨代謝方面的特殊性，同時(shí)，與口腔應(yīng)力負(fù)荷有關(guān)的牙周治療、顳下頜關(guān)節(jié)病治療、口腔修復(fù)和成人口腔正畸也日益普及，因而相應(yīng)的臨床與基礎(chǔ)研究開始出現(xiàn)。口腔環(huán)境里，牙齒承擔(dān)咀嚼功能，故而，牙槽骨及關(guān)節(jié)的骨改建中，力學(xué)影響不容忽視。雌激素和機(jī)械力在調(diào)節(jié)骨改建的過程中，均已有研究涉及到雌激素受體的介導(dǎo)作用，然而雌激素與機(jī)械力復(fù)合條件下，雌激素受體-α介導(dǎo)骨改建的機(jī)制究竟能否追溯到作

2、為成骨細(xì)胞來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，至今仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。 本研究擬分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），經(jīng)礦化成骨誘導(dǎo)液處理，在雌激素、流體剪切力等誘導(dǎo)條件下通過免疫組化、免疫蛋白印跡、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）等方法觀測(cè)雌激素受體的表達(dá)及活性。在阻斷雌激素受體的情況下觀察其成骨能力的變化。進(jìn)一步還可以觀察雌激素和流體剪切力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的雌激素受體及成骨能力的影響是否具有協(xié)同性作

3、用。研究?jī)?nèi)容如下： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)鑒定 為了獲得相對(duì)均一的原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)綜合了密度梯度離心法和全骨髓自然貼壁篩選法的優(yōu)點(diǎn)，從雌性SD大鼠股骨中分離、純化培養(yǎng)出BMSCs，并通過倒置顯微鏡觀察、MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、克隆形成等生物學(xué)行為觀察，初步判斷其活力和均一性。再經(jīng)過流式細(xì)胞儀對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)確定了其具有骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的陽性CD29和CD44表面抗原，同時(shí)由于表面抗原C

4、D11b和CD45的陰性結(jié)果而排除了其為造血干細(xì)胞的可能。再經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志STRO-1陽性染色及成骨、成脂等多向分化誘導(dǎo)，獲得了Von kossa染色的類成骨細(xì)胞和油紅-O（Oil red O）染色的類脂肪細(xì)胞，從而正反論證、確認(rèn)了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞即為BMSCs。 2．雌激素受體-α（Erα）在BMSCs中的動(dòng)態(tài)表達(dá) 本研究旨在觀察BMSCs中的雌激素受體在成骨分化中的作用，故通過細(xì)胞免疫蛋白印記和免疫化學(xué)的方法確證

5、了Erα在BMSCs細(xì)胞核的陽性表達(dá)。 同時(shí)為了獲得在成骨分化中Erα的信息，本實(shí)驗(yàn)又利用具有量化檢測(cè)功能的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-time PCR）對(duì)Erα的基因表達(dá)依BMSCs的培養(yǎng)階段進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)Erα Mrna會(huì)隨細(xì)胞的增殖分化、基質(zhì)分泌礦化等過程發(fā)生基因豐度水平的變化。在相當(dāng)于增殖完成進(jìn)入分化期時(shí)，基因豐度迅速達(dá)到平臺(tái)期，并高位持續(xù)至成骨分化的礦化階段。 3．雌激素對(duì)BMSCs成骨分化的影響

6、 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察生理濃度的雌二醇（E2）能否增強(qiáng)經(jīng)過礦化誘導(dǎo)的BMSCs的成骨分化效應(yīng)。 在不同濃度梯度的E2作用下，BMSCs的增殖和堿性磷酸酶（ALP）活性經(jīng)MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以及ALP活性測(cè)試等實(shí)驗(yàn)證明均有不同程度的提高，其中尤以10-6M的E2作用明顯。再通過不同時(shí)間梯度發(fā)現(xiàn)在此濃度條件下，ALP表達(dá)增強(qiáng)并有時(shí)間依賴性。更重要的是，以上成骨效應(yīng)在用雌激素受體阻斷劑ICI182780處理后，均有明顯降低，提示了雌

7、激素受體在此過程中可能具有一定的中介作用。 4．流體剪切力（FSS）對(duì)BMSCs成骨的影響 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察在FSS的作用下，已經(jīng)礦化誘導(dǎo)的BMSCs的成骨分化效應(yīng)是否能得到增強(qiáng)。 在不同梯度的FSS作用下，BMSCs堿性磷酸酶活性經(jīng)ALP活性實(shí)驗(yàn)證明均有不同程度的提高，其中尤以12dyne/cm2作用明顯。更重要的是，以上成骨效應(yīng)在用ICI182780阻斷雌激素受體后，均有明顯降低，提示了雌激素受體在此過程中也

8、具有一定介導(dǎo)作用。 5．流體剪切力與雌激素雙因素對(duì)BMSCs成骨效應(yīng)的影響 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察在FSS和E2雙因素的作用下，已經(jīng)礦化誘導(dǎo)的BMSCs的成骨分化效應(yīng)是否得到增強(qiáng)。 利用優(yōu)化的12dyne/cm2 FSS復(fù)合10-6M的E2培養(yǎng)，ALP活性和核結(jié)合因子-1（Cbfa1）等成骨特征因子卻呈現(xiàn)基因豐度的減低。應(yīng)用此檢測(cè)，Erα的基因豐度在刺激下無明顯變化，提示二者對(duì)成骨分化沒能表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。 總