可注射式多元RADA肽凝膠的構(gòu)建及其成骨性能的研究.pdf

1、目的:
　　本課題希望構(gòu)建可注射式多重生物活性因子控釋凝膠，由RADA肽(arginine[R]-alanine[A]-aspartate[D]-alanine[A])凝膠和納米羥基磷灰石（nano-Hydroxyapatite，nHA）構(gòu)成支架，聚乳酸-乙醇酸納米顆粒(Poly Lactic-co-Glycolic Acid Nanoparticle，PLGA-NP)包裹重組人骨形成蛋白-2（Reconstruction hum

2、an Bone Morphogenetic Protein-2，rhBMP-2）構(gòu)成緩釋細(xì)胞因子;人牙周膜干細(xì)胞(human Periodontal Ligament Stem Cells，hPDLSCs)構(gòu)成種子細(xì)胞。以期通過復(fù)合支架材料中rhBMP-2的緩釋有效誘導(dǎo)hPDLSCs向成骨細(xì)胞方向分化，并通過可注射式材料提高支架的塑形能力。
　　方法:
　　1)選擇正畸過程中因治療需要拔除的青少年第一前磨牙，收集牙周膜，進(jìn)行

3、原代細(xì)胞培養(yǎng)，并通過分離培養(yǎng)得到hPDLSCs，通過免疫熒光鑒定OCT4(Octamer-binding protein4)表達(dá);流式鑒定hPDLSCs的相關(guān)因子表達(dá)，確定獲得的hPDLSCs可用于后續(xù)研究。
　　2)以rhBMP-2為模型藥，以PLGA為載體材料，制備得到載rhBMP-2的PLGA納米顆粒，通過電鏡檢測(cè)其粒子形態(tài)，并對(duì)其粒徑的大小和分布進(jìn)行測(cè)定，ELISA試劑盒檢測(cè)rhBMP-2的緩釋參數(shù);探索RADA多肽觸發(fā)條

4、件的優(yōu)化方案，篩選RADA膠凝的最佳條件。最后進(jìn)行BMP-2、BMP-2/PLGA-NP，BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA釋放率的測(cè)定。
　　3)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs共培養(yǎng)觀察細(xì)胞的成骨情況:7d檢測(cè)堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP

5、)的活性;14d進(jìn)行茜素紅染色;分別于第7d和14d收取樣本進(jìn)行檢測(cè)和比較兩個(gè)成骨標(biāo)志基因ALP和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)經(jīng)不同處理后的表達(dá)水平。
　　4)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs共培養(yǎng)后注射進(jìn)入裸鼠體內(nèi)，4周后進(jìn)行檢測(cè)成骨情況。Micro-CT掃描檢測(cè)不同分組之間的差異

6、。將小鼠處死后取組織進(jìn)行HE染色觀察組織的病理變化，觀察到成骨現(xiàn)象后進(jìn)行茜素紅檢測(cè)。RT-PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因ALP和OCN的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1)經(jīng)有限稀釋法分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡觀察呈多角型或梭型。對(duì)該類細(xì)胞的表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè):利用免疫熒光染色方法檢測(cè)OCT4的表達(dá)，細(xì)胞發(fā)出明亮的紅色熒光，OCT4陽(yáng)性表達(dá)，提示該細(xì)胞具備干細(xì)胞特性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞CD7表達(dá)量為93.1％、CD90表達(dá)量為95.7

7、％、CD105表達(dá)量為94.8％，均為陽(yáng)性，而CD34、CD45和CD79a表達(dá)則呈陰性。
　　2)在透射電鏡下，載BMP-2的PLGA納米顆粒呈現(xiàn)為球形，粒徑的分布相對(duì)較為均勻;激光粒度儀測(cè)定結(jié)果顯示，其粒徑約為100nm，pdi為0.231。經(jīng)載藥量測(cè)定BMP-2/PLGA-NP中BMP-2包載量為835ng，每毫克凍干粉含BMP-2約20.27ng，包封率約為17％。采用單因素考察篩選RADA的觸發(fā)條件，確定了RADA凝膠觸

8、發(fā)的最佳條件為:RADA濃度1％，觸發(fā)劑0.5％Tris，觸發(fā)時(shí)間0.25h時(shí)。該條件下可以使RADA膠凝，有一定的彈性，并具有固定的形態(tài)，不具有流動(dòng)性。BMP-2、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA在透析袋內(nèi)的釋放情況表明:PLGA有明顯的藥物緩釋功能，RADA凝膠對(duì)藥劑成分的擴(kuò)散也有明顯的阻滯作用，但他們單獨(dú)作用時(shí)都不足以讓BMP-2對(duì)牙周膜干細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生持續(xù)性的促進(jìn)作用。將二者

9、結(jié)合，即將BMP-2包裹至PLGA納米粒后再分散至RADA凝膠中，使納米粒在靜態(tài)環(huán)境中更加緩慢地釋放藥物，疊加凝膠的阻滯擴(kuò)散作用，最終使得BMP-2的緩釋作用超過21d。
　　3)RADA和hPDLSCs共培養(yǎng)14d后，細(xì)胞未見明顯的成骨分化:nHA對(duì)PDLSCs向成骨細(xì)胞分化有一定的促進(jìn)作用。BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA與hPDLSCs共培養(yǎng)后均能

10、使hPDLSCs向成骨方向誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)14d后觀察BMP-2/PLGA-NP組、BMP-2/PLGA-NP/RADA組和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組都能明顯地觀察到成骨現(xiàn)象。ALP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RADA凝膠并不能提高ALP的活性;BMP-2/PLGA-NP組、BMP-2/PLGA-NP/RADA組ALP活性增強(qiáng)，與RADA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組ALP活性增加

11、最為明顯，與RADA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。在第14d的茜素紅檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA染色后礦化結(jié)節(jié)最明顯，nHA組有少量礦化結(jié)節(jié)，而RADA組無法觀察到。對(duì)成骨標(biāo)志基因ALP、OCN表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)RADA凝膠處理后ALP、OCN表達(dá)量均沒有明顯升高，較PDLSCs組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-N

12、P/RADA/nHA組ALP、OCN的表達(dá)量明顯升高，其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組最高，三組較PDLSCs組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　4)將RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分別與hPDLSCs混合后接種于裸鼠背部，4周后Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMP-2/PLGA-NP、BMP-

13、2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA能夠觀察到較為致密的組織形態(tài);各實(shí)驗(yàn)組通過HE染色和茜素紅染色都能夠明顯觀察到有類似成骨組織和礦化結(jié)節(jié)。植入hPDLSCs+RADA凝膠的裸鼠中ALP和OCN表達(dá)量與接種hPDLSCs細(xì)胞組沒有差異;而其他各組注射后裸鼠4周后OCN和ALP基因表達(dá)量均明顯提高(p＜0.01)。而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA

14、-NP/RADA/nHA組ALP、OCN表達(dá)量明顯升高，其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA組最高，三組較PDLSCs組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究成功構(gòu)建了多元RADA肽凝膠支架復(fù)合體，該復(fù)合體可以以溶液形式注射給藥，到達(dá)給藥部位后通過離子化膠凝機(jī)制形成凝膠支架。該支架可以為hPDLSCs提供三維生長(zhǎng)環(huán)境。同時(shí)在該支架內(nèi)，生物可降解的PLGA納米?？梢跃徛尫臖MP-2，與nHA