仿骨成分多元摻雜納米羥基磷灰石體外成骨性能研究.pdf

1、骨缺損是指因外傷、腫瘤、疾病等因素導(dǎo)致的骨結(jié)構(gòu)完整性破壞，是臨床工作中一個常見難題，極大地影響到患者的美觀和身心健康。目前臨床對骨缺損的治療主要采用骨替代物植入的方法，即在骨缺損部位植入自體骨、異體骨、異種骨來修復(fù)骨缺損。但由于這些方法均存在一定不足，如:自體骨移植來源有限，可能出現(xiàn)術(shù)中失血和術(shù)后疼痛等問題;異體骨、異種骨移植存在傳播疾病的風(fēng)險和免疫排斥的可能。隨著臨床對骨替代材料要求的不斷提高，研制具有良好生物相容性、生物降解性、骨傳

2、導(dǎo)性的人工合成骨缺損修復(fù)材料已成為治療骨缺損領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）因與天然骨組織無機(jī)結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性，使其成為臨床工作中應(yīng)用最為廣泛的人工合成骨缺損修復(fù)材料。然而純羥基磷灰石材料具有難降解、骨整合速率低、力學(xué)強(qiáng)度差等缺點(diǎn)，在一定范圍內(nèi)制約了其臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)天然骨組織無機(jī)成分中的HA，并非完全按照標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)計量學(xué)以Ca10(P04)6(OH)2的形式存在，而是被不同離子（

3、鎂、鈉、鉀、鍶、硅、氟、碳）置換取代。天然骨的無機(jī)成分中含有鎂、鈉、鉀、鍶、硅、氟、碳等多種不同的微量元素，缺乏這些微量元素可增加骨折的風(fēng)險。目前在羥基磷灰石基礎(chǔ)上添加一種或某幾種元素改性羥基磷灰石的方法得到較為廣泛的研究，但國內(nèi)外對于多元摻雜仿生羥基磷灰石的研究仍處于空白。中科院上海硅酸鹽研究所依據(jù)人體骨微量元素的含量，將Na、K、Mg、A1、Zn、Sr、Si、F和C等多種元素按照人體骨骼成分摻入羥基磷灰石晶格內(nèi)部，制備出仿人體骨成分

4、的多元摻雜納米羥基磷灰石材料。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)以水熱法制備出非摻雜納米羥基磷灰石(HA1)為參照，對比研究相同條件下制備出的新型仿生多元摻雜納米羥基磷灰石（HA2）對成骨前體細(xì)胞分化及成骨作用的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)第一部分:水熱法制備多元摻雜羥基磷灰石粉體及非摻雜羥基磷灰石粉體，電鏡觀察兩者顆粒大小及形態(tài)。實(shí)驗(yàn)第二部分:制備不同濃度的多元摻雜羥基磷灰石粉體懸液并測定其在不同濃度條件下其對成骨前體細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)第三部分:

5、分四組進(jìn)行:對照組（細(xì)胞培養(yǎng)液）;礦化組（礦化誘導(dǎo)液）;礦化+ HA1（含0.05mg/ml HA1的礦化誘導(dǎo)液）;礦化+HA2（含0.05mg/ml HA2的礦化誘導(dǎo)液），對比在礦化誘導(dǎo)液作用下非摻雜納米羥基磷灰石與多元摻雜納米羥基磷灰石對成骨前體細(xì)胞成骨作用的影響。實(shí)驗(yàn)第四部分:分四組進(jìn)行:對照組（細(xì)胞培養(yǎng)液）;礦化組（礦化誘導(dǎo)液）;HA1（含0.05mg/ml HA1的細(xì)胞培養(yǎng)液）;HA2（含0.05mg/ml HA2的細(xì)胞培養(yǎng)液

6、），對比去除礦化誘導(dǎo)液作用后，兩種不同粉體材料是否也對成骨前體細(xì)胞具有礦化成骨的作用。
　　結(jié)果:1、通過電鏡掃描觀察單純納米羥基磷灰石(HA1)和多元摻雜納米羥基磷灰石(HA2)具有等級結(jié)構(gòu)，摻雜并沒有改變羥基磷灰石形顆粒大小及形貌。2、(1)當(dāng)多元摻雜羥基磷灰石粉體（HA2）濃度在0-0.05mg/ml范圍內(nèi)可促進(jìn)成骨前體細(xì)胞(MC3 T3-E1)增殖，當(dāng)HA2濃度高于0.05 mg/ml，HA2會抑制成骨前體細(xì)胞增長。(2)

7、進(jìn)一步通過Hochest33342/PI雙染發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)HA2的濃度為0.5mg/ml和0.125mg/ml時會造成一定程度的細(xì)胞凋亡，且凋亡染色的強(qiáng)度與粉體濃度及處理時間呈正比。當(dāng)粉體濃度降至0.05mg/ml時處理組凋亡現(xiàn)象不明顯。3、(1)通過堿性磷酸酶活性染色觀察發(fā)現(xiàn):礦化、礦化+HA1、礦化+HA2均可使成骨前體細(xì)胞的ALP活性增強(qiáng)，對照組成骨前體細(xì)胞也具有少量的ALP活性，但其染色強(qiáng)度明顯不及其他三組。礦化+HA1組、礦

8、化+HA2組均比礦化組更易促進(jìn)細(xì)胞ALP活性。其中，礦化+HA2組比礦化+HA1組更有益于成骨前體細(xì)胞ALP活性表達(dá)。(2)通過半定量PCR測量發(fā)現(xiàn):與對照組相比，礦化組、礦化+HA1組和礦化+HA2組均可促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、OCN、OPN的高表達(dá)，在礦化誘導(dǎo)液基礎(chǔ)上加入了HA1、HA2的兩組比單純礦化組對三組基因變化的影響作用強(qiáng)，且在礦化誘導(dǎo)液作用下加入HA2刺激作用明顯強(qiáng)于HA1。其中，ALP基因水平組間差異在處理后的第3天開始

9、體現(xiàn)(p＜0.005)，礦化+HA2組對ALP基因水平的促進(jìn)作用明顯高于礦化+HA1組。隨著培養(yǎng)時間延長，組間差異不斷增大(p＜0.0001)。ALP水平在礦化誘導(dǎo)第10天達(dá)到高峰，在第14天下降。其中，OCN的基因水平在處理的早期階段并未出現(xiàn)明顯差異，從第5天起各組間才開始逐漸產(chǎn)生差異(p＜0.05)，礦化+HA2組對OCN基因水平的促進(jìn)作用高于礦化+HA1組且隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組間差異不斷增加。其中，OPN基因水平在處理的第3天

10、開始產(chǎn)生組間差異，其中礦化+HA1組和礦化+HA2組的OPN基因的水平明顯高于礦化組和對照組，但礦化+HA1組和礦化+HA2組的組間差異從第5天才開始體現(xiàn)(p＜0.05)，且礦化+HA2組更易于促進(jìn)OPN的基因表達(dá)。(3)茜素紅染色發(fā)現(xiàn):除對照組外所有處理組在15天均可以看到一些礦化小顆粒形成，繼續(xù)培養(yǎng)至第21天可見典型礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，紅染的塊狀結(jié)節(jié)代表礦化成骨的效果。研究發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1作為成骨前體細(xì)胞不能自行發(fā)生礦化成骨作用，但礦

11、化組、礦化+HA1組、礦化+ HA2組均可以使其產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)。礦化結(jié)節(jié)的多少及染色強(qiáng)度關(guān)系為:礦化+ HA2組＞礦化+HA1組＞礦化誘導(dǎo)組。4、當(dāng)去除礦化誘導(dǎo)液的作用后，通過觀察對照組、礦化組、HA1組、HA2組的堿性磷酸酶染色、成骨基因半定量PCR測量及茜素紅染色發(fā)現(xiàn):單純的HA1、HA2粉體對成骨前體細(xì)胞同樣具有礦化誘導(dǎo)及促進(jìn)分化的作用，且HA2的礦化誘導(dǎo)作用比HA1作用更強(qiáng)。
　　結(jié)論:1、中科院硅酸鹽研究所根據(jù)人體骨骼中各

12、微量元素的含量配比制備出多元摻雜納米羥基磷灰石，觀察發(fā)現(xiàn)摻雜多種元素并未引起羥基磷灰石尺寸及大小的明顯變化，所制備的材料的顆粒尺寸與同樣方法制備出的非摻雜納米羥基磷灰石顆粒相似。2、在本實(shí)驗(yàn)條件下最適于研究仿生多元摻雜羥基磷灰石粉體對成骨前體細(xì)胞生物學(xué)作用的溶液濃度為0.05mg/ml。3、對照組不能使成骨前體細(xì)胞產(chǎn)生礦化作用，另外三組可以使其產(chǎn)生礦化作用，其中礦化+HA1、礦化+HA2組比礦化組對成骨前體細(xì)胞礦化作用更強(qiáng)，礦化+HA2