新型自組裝肽水凝膠對成骨前體細(xì)胞粘附、增殖和成骨作用的研究.pdf

1、臨床上治療骨腫瘤切除、創(chuàng)傷或感染引起的骨缺損，以及進(jìn)行關(guān)節(jié)或脊柱植骨融合等手術(shù)時常常需要大量骨填充材料對缺損和融合區(qū)域進(jìn)行骨移植。目前，自體骨移植仍然是臨床治療此類疾病時的首選方法，但是由于骨量來源有限、取材區(qū)疼痛以及增加感染風(fēng)險(xiǎn)等因素，限制了其在臨床上的運(yùn)用。為了填補(bǔ)自體骨移植材料的不足，合成骨填充材料，如陶瓷材料、羥基磷灰石等也已經(jīng)運(yùn)用于臨床，但其存在細(xì)胞黏附率低和生物相容性差等缺點(diǎn)。隨著近年來骨組織工程學(xué)對支架材料研究的迅速發(fā)展，

2、科學(xué)家們通過對合成材料進(jìn)行表面修飾或者替換，為上述問題帶來新的解決辦法。
　　RADA16-Ⅰ是自組裝肽（self-assembling peptide，SAP）的代表，其由16個氨基酸殘基組成，其在生理鹽溶液觸發(fā)下，16肽氨基酸形成β-折疊結(jié)構(gòu)，并相互間往復(fù)排列形成互補(bǔ)離子鍵，最終自組裝形成納米纖維(直徑10～20nm)。研究表明，此種自組裝多肽水凝膠能夠形成含水量大于99％，孔徑5～200nm的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過模擬與體內(nèi)相近

3、似細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和微環(huán)境，為細(xì)胞在體外支架材料表面的粘附、增殖和分化創(chuàng)造有利條件。近年來，科學(xué)家們通過向傳統(tǒng)RADA16-Ⅰ的C末端連接活性功能序列的方法，構(gòu)建出具有更優(yōu)異生物學(xué)性能的新型的自組裝肽水凝膠支架材料。
　　Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是甲狀旁腺類激素相關(guān)蛋白(PTHrP)在C末端的結(jié)構(gòu)域。研究表明， PTHrP(107～111)五肽片

4、段能通過介導(dǎo)PTH/PTHrP受體非相關(guān)性受體，在體外能夠促進(jìn)成骨前體細(xì)胞(preosteoblast)分化和生長，并能促進(jìn)兔骨缺損的修復(fù)。本研究通過利用PTHrP(107～111)片段對傳統(tǒng)RADA16-Ⅰ的C末端進(jìn)行功能化修飾，期望得到一種兼顧細(xì)胞粘附和促進(jìn)成骨相關(guān)生物學(xué)性能的自組裝肽水凝膠支架材料。
　　目的:(1)觀察新型自組裝肽水凝膠納米結(jié)構(gòu)，檢測其自組裝性能;
　　(2)評估MC3T3-E1細(xì)胞在新型自組裝肽水凝

5、膠上的細(xì)胞粘附性能;
　　(3)檢測MC3T3-E1細(xì)胞在新型自組裝肽水凝膠上的細(xì)胞增殖效果和生長情況;
　　(4)評價(jià)新型自組裝肽水凝膠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的效果。
　　方法:(1)將自組裝多肽溶液稀釋液滴加到潔凈云母表面，通過原子力顯微鏡(atomicforce microscopy，AFM)觀察自組裝肽在云母表面形成的納米結(jié)構(gòu);
　　(2)按照分組運(yùn)用在14mm玻片上滴加不同材料成膠，制作爬片，

6、而后爬片放入24孔板內(nèi)，并接種細(xì)胞懸液，觀察不同時間點(diǎn)各分組材料表面粘附細(xì)胞數(shù)，檢測細(xì)胞粘附性能。
　　(3)以CCK-8法評價(jià)不同時間點(diǎn)、不同材料表面生長的MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況。
　　(4)通過激光共聚焦顯微鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞在各時間點(diǎn)各材料表面的生長情況，以及在不同HA/β-TCP復(fù)合材料上培養(yǎng)14d時的生長情況;
　　(5)茜素紅-S染色觀察MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面生長14d時的鈣結(jié)節(jié)

7、形成情況;
　　(6)檢測不同時間點(diǎn)、不同材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性以及MC3T3-E1細(xì)胞在材料表面生長14d時ALP、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)在原子力顯微鏡下分別對TRSAW、RADA16-Ⅰ、RADA16/

8、TRSAWRADA16-Ⅰ和TRASWmx四組短肽進(jìn)行觀察，TRSAW組呈云絮狀改變，無法形成納米纖維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。RADA16/TRSAW組能夠形成不規(guī)則的斑片樣纖維，直徑不規(guī)則，纖維之間無法連接搭載;但是，將RADA16/TRSAW與RADA16-Ⅰ稀釋液按1:1體積比例混合后得到的TRSAWmx能夠得到近似于RADA16-Ⅰ的長納米纖維，且能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，兩者有自組裝性能;通過原子力顯微鏡檢測結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用空白組、RADA16

9、-Ⅰ組和TRSAWmx組進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。
　　(2)對各個時相點(diǎn)在三種材料表面的粘附MC3T3-E1細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，第10min時，空白組與RADA16-Ⅰ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);在第30、60min和90min時，空白組分別與TRSAWmx組與RADA16-Ⅰ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，RADA16-Ⅰ與TRSAWmx間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3) CCK-8檢測細(xì)胞各個時相點(diǎn)MC3T3-

10、E1細(xì)胞在不同材料表面的增殖情況，培養(yǎng)1天時空白組與TRSAWmx和RADA16-Ⅰ組有顯著差異（P＜0.05），TRSAWmx和RADA16-Ⅰ組統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異（P＞0.05）;第3、5和7天空白組、TRASWmx組和RADA16-Ⅰ組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　(4)在激光共聚焦顯微鏡下對分別接種于不同材料的平面上的MC3T3-E1細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察，可見接種培養(yǎng)的3d、7d和14d后，各分組細(xì)胞骨架排列連續(xù)，纖

11、維結(jié)構(gòu)沿著細(xì)胞長軸延伸;不同時間節(jié)點(diǎn)TRSAWmx組細(xì)胞數(shù)目均較空白及RADA16-Ⅰ組增加(P＜0.05)。在HA/β-TCP多孔支架材料上培養(yǎng)14天后，TRSAWmx組的細(xì)胞密度明顯高于其他組別。
　　(5)檢測不同時相點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面的ALP活性，結(jié)果顯示在3d、7d和14d時，TRASWmx組和空白組、RADA16-Ⅰ組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(6)茜素紅-S染色結(jié)果顯示，通過14d

12、誘導(dǎo)培養(yǎng)后空白組細(xì)胞密度較其他兩組小，中間少量鈣結(jié)節(jié)形成;RADA16-Ⅰ組中細(xì)胞密度較大，能夠見到多個鈣結(jié)節(jié)形成;而TRSAWmx組中可見較多橘紅色的鈣結(jié)節(jié)著色。
　　(7) ReaI-time PCR結(jié)果顯示，在TRSAWmx組中培養(yǎng)的細(xì)胞，ALP、OCN和VEGF基因的相對表達(dá)量高于空白組和RADA16-Ⅰ組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過肽固相合成法將甲狀旁腺類激素相關(guān)蛋白（PTHrP）的高活性片段PTHrP(10

13、7～111)與傳統(tǒng)RADA16-Ⅰ的C末端相連，并通過與傳統(tǒng)自組裝肽RADA16-Ⅰ混合得到的新型自組裝水凝膠多肽，經(jīng)試驗(yàn)證明TRSAWmx自組裝肽水凝膠具有良好的細(xì)胞粘附性、促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨誘導(dǎo)相關(guān)性能，作為一種新型支架材料能夠?yàn)榧?xì)胞的體外培養(yǎng)提供適合的環(huán)境，為后期與羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）等材料相復(fù)合，進(jìn)一步探索復(fù)合材料