植物(豆芽)吡哆胺—吡哆醛轉(zhuǎn)換反應作用酶的分離純化及表征.pdf

1、維生素B6(VB6)是一類吡啶化合物的總稱,游離型為吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxine,PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),三者相應磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式,參加催化涉及氨

2、基酸的各種代謝反應,在其他多種物質(zhì)的合成和代謝過程中也發(fā)揮著重要作用。
　　PM-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(Pyridoxamine-Pyruvate aminotransferase,PPAT)催化PM和PL之間的相互轉(zhuǎn)化,它以PM和丙酮酸為底物生成PL和L-丙氨酸,同時谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)在脫掉PLP輔基的條件下也可以催化PM和PL的相互轉(zhuǎn)化,這些分別在微生物和動物中被發(fā)

3、現(xiàn)證實,植物體內(nèi)也存在PM和PL的相互轉(zhuǎn)化,但作用酶及其酶的性質(zhì)還不明確。
　　本論文首先對豆芽中的GOT進行分離純化,粗酶液經(jīng)過兩次硫酸銨分段沉淀、兩次Sephadex G-100凝膠過濾柱層析、兩次DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析等分離純化技術(shù),GOT被純化了200.8倍,通過對純化酶的底物特異性分析,發(fā)現(xiàn)GOT全酶并不能催化PM和丙酮酸反應生成PL和丙氨酸,只有在脫PLP輔基(pH2.7)的條

4、件下,才能催化PM和草酰乙酸反應生成PL。
　　對豆芽中的GOT進行純化分析后,再對豆芽中的PPAT進行分離純化,通過兩次硫酸銨分段沉淀、兩次Sephadex G-100凝膠過濾柱層析、兩次DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析等分離純化技術(shù),對新鮮豆芽中的吡哆胺-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶進行分離純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,樣品呈現(xiàn)單一條帶。研究結(jié)果表明:該酶被純化了207.56倍,得率為7.84％;通過底物特