Nox4型NADPH氧化酶在TGF-β調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和表型分化中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分：Nox4及氧化還原信號(hào)通路在TGF-β調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)在調(diào)節(jié)心血管生理和疾病中發(fā)揮多種作用，而其中重要的作用之一就是調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞功能。TGF-β信號(hào)通路的失衡會(huì)導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育的異常，而且TGF-β在出生后毛細(xì)血管新生中發(fā)揮重要的作用。除此之外，研究結(jié)果提示TGF-β能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，凋亡，通透性變化和形態(tài)發(fā)生。有證據(jù)表明在有心血管疾

2、病危險(xiǎn)因素的患者中TGF-β血漿濃度是升高的，這些危險(xiǎn)因素包括肥胖和糖尿病。而且，研究檢測(cè)到患有先兆子癇的女性循環(huán)血中TGF-β的水平是升高的。在易患動(dòng)脈粥樣硬化的載脂蛋白E基因敲除小鼠中，TGF-β表達(dá)增加導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能紊亂。重要的是，TGF-β在內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)作用往往是矛盾的（或有保護(hù)作用或者是有害的），作用的不同取決于細(xì)胞的環(huán)境和細(xì)胞的類型。
　　在內(nèi)皮細(xì)胞中，TGF-β發(fā)揮作用主要由活化素受體樣激酶1(

3、ALK1)和ALK5兩種膜受體介導(dǎo)。激活的ALK1受體磷酸化Smad1/5/8，然而ALK5的激活引起Smad2/3的磷酸化。這些活化的Smad蛋白與Smad4結(jié)合，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物調(diào)節(jié)各種各樣靶基因的表達(dá)，然而ALK1和ALK5的激活可能會(huì)引起不同的內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。除這些經(jīng)典信號(hào)途徑外，最近研究提示NADPH氧化酶依賴的氧化還原機(jī)制或許介導(dǎo)了TGF-β生物學(xué)作用的調(diào)節(jié)。特別是，TGF-β特異性上調(diào)多種細(xì)胞中Nox4型NADP

4、H氧化酶的表達(dá)。更重要的是，這些研究證實(shí)阻斷Nox4的表達(dá)或功能抑制TGF-β對(duì)多種細(xì)胞功能的影響，提示Nox4在TGF-β信號(hào)通路中發(fā)揮重要的作用。
　　多項(xiàng)證據(jù)表明TGF-β能引起不同類型內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，然而TGF-β引起凋亡的信號(hào)機(jī)制還知之甚少。研究證實(shí)TGF-β引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這種作用依賴于ALK5-Smad2通路和下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2和cFLIP。另一方面，多項(xiàng)研究指出p38絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)

5、介導(dǎo)了TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。然而，迄今為止鮮有研究表明TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡涉及氧化還原依賴的信號(hào)途徑。鑒于最近的結(jié)果顯示活性氧簇(ROS)生成的增加或許在TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡中有重要作用，我們提出以下假設(shè):Nox4依賴的氧化還原調(diào)節(jié)途徑或許介導(dǎo)了TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　研究目的：
　　1.TGF-β在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　2.Nox4氧化還原信號(hào)通路是否介導(dǎo)了TGF-β引起的

6、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　　3.MAPK信號(hào)通路在TGF-β引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　研究方法：
　　1.人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs和永生化的人微細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞HMVECs購(gòu)買自ATCC。細(xì)胞在含有5％胎牛血清的完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)中培養(yǎng)，置于5％CO2，37℃條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第3到6代之間的HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.

7、Caspase3/7活性測(cè)定
　　培養(yǎng)在96孔板中的細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入Caspase-Glo3/7試劑檢測(cè)Caspase3/7活性。樣品轉(zhuǎn)移到白色96孔板中，用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀進(jìn)行讀板測(cè)定。
　　3.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　處理細(xì)胞后，用裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后用特異性一抗4℃孵育過夜，然后二抗室溫2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的

8、蛋白條帶，LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。
　　4.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定（TUNEL）法按照Millipore的步驟進(jìn)行，其中標(biāo)記的棕褐色為凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，綠色為正常細(xì)胞。隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比值作為細(xì)胞凋亡率。
　　5.ROS檢測(cè)
　　細(xì)胞內(nèi)的ROS用DCFH-DA熒光染料檢測(cè)，處理后的細(xì)胞

9、加入DCFH-DA在37℃孵育20分鐘并用激光共聚焦顯微鏡拍照留取圖片，或者將DCFH-DA孵育的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到96孔白板中檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
　　6.線粒體膜電位（△Ψm）的檢測(cè)
　　熒光探針JC-1用來檢測(cè)線粒體膜電位的變化。藥物處理后的細(xì)胞用JC-1進(jìn)行染色，然后流式細(xì)胞術(shù)或者激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)紅綠熒光的變化。
　　7.Nox4干擾試驗(yàn)
　　從備選的3條Nox4shRNA中挑選出干擾效率最高的一條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，攜

10、帶有Nox4shRNA和對(duì)照shRNA的慢病毒載體由上海吉瑪公司構(gòu)建。其中靶向Nox4的shRNA序列是5'GCTGTATATTGATGGTCCTTT3'，對(duì)照shRNA序列為5'GGTGTCTTCGAATTTATGTCT3'。將慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平的表達(dá)
　　TRIzol試劑提取處理細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Taqman探針-引物體系進(jìn)行PCR，18

11、S作為管家基因檢測(cè)mRNA表達(dá)的相對(duì)變化。
　　9.細(xì)胞免疫熒光法
　　培養(yǎng)于Lab-Tek腔室玻片上的細(xì)胞固定后，加一抗和熒光二抗孵育，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡拍照。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）分別分析兩組和多組數(shù)據(jù)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.TGF-β引

12、起人內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡反應(yīng)
　　用不同濃度的TGF-ββ刺激HUVECs24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)TGF-β在濃度范圍1ng/ml到20ng/ml時(shí)引起明顯的caspase3/7活性增加和caspase3裂解。用10ng/mlTGF-β刺激HUVECs不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)TGF-β引起的凋亡作用是隨時(shí)間變化的，24和48小時(shí)效果最強(qiáng)。我們還選用了另一種內(nèi)皮細(xì)胞HMVECs進(jìn)行研究。用不同濃度的TGF-β刺激HMVECs24小時(shí)和用10ng/mlTGF-β

13、刺激不同的時(shí)間發(fā)現(xiàn)，TGF-β以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式引起HMVECs相似的凋亡反應(yīng)。
　　2.TGF-β引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是由ALK5受體介導(dǎo)的
　　通過測(cè)定caspase3/7活性和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)caspase3裂解，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用被ALK5的抑制劑SB431542所阻斷。而且，結(jié)果顯示TGF-β能引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的下降，這種作用也被SB431542所抑制。通過檢測(cè)caspase

14、3/7的活性，發(fā)現(xiàn)staurosporine引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡不能被SB431542所阻斷，證明了SB431542在TGF-β凋亡作用中的特異性。
　　3.TGF-β通過ROS引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　　TGF-β引起內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加，而且TGF-β引起的ROS增加被SB431542所抑制，說明TGF-β通過ALK5受體使細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。兩種ROS清除劑NAC和EUK-134均能阻斷TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而RO

15、S清除劑本身有輕微的抗凋亡作用（無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。
　　4.TGF-β上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中Nox4的表達(dá)
　　首先，用TGF-β刺激HUVECs發(fā)現(xiàn)TGF-β增加Nox4mRNA的表達(dá)和上調(diào)Nox4的蛋白表達(dá)水平。而加入ALK5受體抑制劑后，TGF-β上調(diào)Nox4表達(dá)的作用被抑制，說明TGF-β是通過ALK5受體激活引起Nox4轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化的。同時(shí)，我們用細(xì)胞免疫熒光的方法證實(shí)了TGF-β及ALK5對(duì)Nox4表達(dá)及分布的影響

16、。Nox4不僅在胞漿中存在，還分布于細(xì)胞核中，TGF-β刺激后，胞漿和胞核中的Nox4都增加了。
　　5.Nox4在TGF-β引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　研究發(fā)現(xiàn)TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用被Nox4shRNA所阻斷，而本身Nox4shRNA沒有明顯的抗凋亡作用。用Nox4的抑制劑VAS2870預(yù)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)VAS2870阻斷了TGF-β對(duì)caspase3的激活，caspase3的裂解和線粒體膜電位的下降。

17、　　6.MAPKs在TGF-β引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　TGF-β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，p38的磷酸化增加，從12小時(shí)開始一直持續(xù)到48小時(shí)。相反，JNK的磷酸化水平只是在12小時(shí)一過性增高。我們用p38和JNK特異的激酶抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，證明抑制p38通路能阻斷TGF-β的致凋亡作用，而JNK抑制劑沒有作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們用p38和JNK特異的siRNA干擾p38和JNK通路，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與用激酶抑制劑相一致。
　　7.TG

18、F-β通過氧化還原信號(hào)途徑激活MAPKs
　　NAC預(yù)處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，NAC完全阻斷了TGF-β引起的p38的磷酸化。然而，NAC本身則增加了JNK的磷酸化，而有NAC存在時(shí)TGF-β引起的JNK的磷酸化不明顯。這些結(jié)果提示p38和JNK的激活都是氧化還原敏感的。而且，用VAS2870抑制Nox4的功能削弱了TGF-β引起的p38磷酸化水平的增加。不同于MAPKs，無論在基礎(chǔ)狀態(tài)，還是有NAC或VAS2870存在的條件下，TGF-

19、β對(duì)Akt的磷酸化水平?jīng)]有影響。
　　結(jié)論：
　　1.TGF-β通過ALK5受體引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡反應(yīng)
　　2.TGF-β通過增加Nox4表達(dá)和ROS的生成增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡3.p38介導(dǎo)了TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　第二部分：過表達(dá)外源性Nox4在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制
　　研究背景：
　　ROS是生物系統(tǒng)中普遍存在的信號(hào)分子，ROS的來源主要是NADPH氧化酶。NADPH氧化酶(Nox

20、)家族由7個(gè)成員組成，包括Nox1-5和Duox1、2，其中4種類型的NADPH氧化酶是血管系統(tǒng)中ROS的重要來源:Nox1，Nox2，Nox4和Nox5。NADPH氧化酶將電子從NADPH傳遞到氧分子從而產(chǎn)生ROS，ROS包括局部有效的超氧化物和作用持久的具有膜擴(kuò)散特性的過氧化氫(H2O2)。Nox4與其他類型的NADPH氧化酶不同的是其在心血管組織中的高表達(dá)，獨(dú)特的固有酶活性和主要產(chǎn)生ROS的類型是H2O2。
　　Nox4是一

21、個(gè)多效性的信號(hào)分子，具有多種功能，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、血管新生和細(xì)胞骨架重構(gòu)等。研究表明Nox4在很多心血管疾病中表達(dá)增加，比如粥樣硬化、高血壓、再狹窄、血管老化和纖維化等。最近越來越多的研究結(jié)果顯示Nox4具有正反兩方面的作用，由于Nox4過表達(dá)小鼠模型的成功建立，研究者得出了驚人的結(jié)果，Nox4實(shí)際上具有血管保護(hù)作用而非血管損傷作用。
　　我們之前的研究表明在內(nèi)皮細(xì)胞中Nox4表達(dá)的增加或許會(huì)通過激活ERK1/2MA

22、PK通路增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖（認(rèn)為是一個(gè)促進(jìn)存活的作用）。因此在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D解釋Nox4在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和存活方面看似相反的作用。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是ROS敏感的酶類，可以被ROS氧化而失去其酶活性。PTPs負(fù)調(diào)控多種受體酪氨酸激酶(RTKs)，這些RTK的配體包括EGF、IGF-1、PDGF和VEGF。PTP1B是第一個(gè)被提純分離的經(jīng)典型PTP，是2型糖尿病、肥胖和腫瘤的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。PTEN作為一個(gè)重

23、要的腫瘤抑制物也是一種PTP，研究發(fā)現(xiàn)其在大部分人類的腫瘤中突變。之前研究表明，PTPs通過去磷酸化磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PIP3)抑制Akt信號(hào)通路。我們?cè)诖瞬糠痔骄縋TPs及Akt是否參與了過表達(dá)Nox4對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
　　研究目的：
　　1.過表達(dá)外源性Nox4在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　2.Akt通路及ERK1/2通路在過表達(dá)外源性Nox4抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　3.PTPs是否參與了

24、過表達(dá)外源性Nox4對(duì)Akt通路的激活及作用機(jī)制
　　研究方法：
　　1.慢病毒或腺病毒過表達(dá)Nox4
　　人類野生型Nox4的cDNA克隆購(gòu)買自O(shè)rigene，亞克隆到pLV.EX3d.P/neo-EF1A。表達(dá)Nox4或eGFP的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)之后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。感謝Goldstein教授贈(zèng)與的表達(dá)人野生型Nox4的腺病毒。
　　2.Caspase3/7活性測(cè)定
　　細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入Cas

25、pase-Glo3/7試劑檢測(cè)Caspase3/7活性。加入檢測(cè)試劑的樣品轉(zhuǎn)移到白色96孔板中，讀板測(cè)定。
　　3.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后一抗孵育過夜，然后二抗孵育2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶，LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。
　　4.細(xì)胞免疫熒光法
　　培養(yǎng)于Lab-Tek腔室玻片上的細(xì)胞固定后，加一抗

26、和熒光二抗孵育，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡拍照。
　　5.蛋白質(zhì)免疫沉淀
　　細(xì)胞裂解液預(yù)清洗之后，加入一抗和蛋白A或G瓊脂糖珠進(jìn)行孵育，然后通過離心去除瓊脂糖珠。將蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加一抗二抗孵育，最后化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白條帶。
　　6.PTP1B活性測(cè)定
　　處理細(xì)胞后，免疫沉淀獲取PTP1B蛋白，用購(gòu)買自Millipore的PTP比色試劑盒，按照說明書

27、的方法檢測(cè)PTP1B的活性。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.過表達(dá)外源性Nox4對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡反應(yīng)
　　研究結(jié)果證實(shí)慢病毒或腺病毒過表達(dá)Nox4(vNox4)不僅抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡反應(yīng)而且抑制了血清饑餓引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，還減

28、少了staurosporine導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。另外，我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)Nox4后，再給予TGF-β刺激，并不能引起明顯的凋亡反應(yīng)。
　　2.過表達(dá)外源性Nox4通過激活A(yù)kt發(fā)揮抗凋亡作用
　　我們檢測(cè)了vNox4對(duì)促進(jìn)存活因子Akt和ERK1/2的作用，結(jié)果顯示vNox4劑量依賴性增加Akt的磷酸化水平。但是，vNox4組與對(duì)照病毒組相比，并沒有引起明顯的ERK1/2激活。用Akt通路抑制劑Ⅶ或wortmann

29、in處理細(xì)胞能明顯減弱vNox4的抑制凋亡作用，而ERK1/2抑制劑U0126沒有這種作用。我們也證實(shí)用特異性siRNA干擾Akt表達(dá)后部分阻斷了vNox4的抗凋亡作用。鑒于TGF-β不影響Akt的磷酸化水平，以上數(shù)據(jù)提示vNox4對(duì)Akt的激活或許是內(nèi)源性和過表達(dá)Nox4對(duì)凋亡反應(yīng)作用不同的原因。
　　3.過表達(dá)外源性Nox4與內(nèi)源性Nox4亞細(xì)胞分布相同
　　為了明確過表達(dá)Nox4和內(nèi)源性Nox4是否存在亞細(xì)胞分布的不同

30、，免疫熒光法檢測(cè)過表達(dá)Nox4的細(xì)胞中Nox4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在胞漿和胞核中均增加，與之前TGF-β刺激后的反應(yīng)相似，由此看來細(xì)胞分布不是過表達(dá)Nox4作用不同的原因。
　　4.PTPs抑制劑對(duì)Akt磷酸化的影響
　　為了研究vNox4激活A(yù)kt的信號(hào)機(jī)制，我們首先驗(yàn)證了兩個(gè)涉及細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)途徑的ROS敏感的PTP1B和PTEN受抑制之后是否影響Akt的磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTP1B的抑制劑而非PTEN的抑制劑處理內(nèi)

31、皮細(xì)胞之后，Akt的磷酸化水平增加了。抑制PTP1B的作用類似于VEGF引起的作用，然而VEGF并沒有在存在PTP1B抑制劑的條件下進(jìn)一步增加Akt的磷酸化。相反，VEGF在存在和缺少PTEN抑制劑的條件下，對(duì)Akt有相似的激活作用。
　　5.vNox4抑制PTP1B活性和增加VEGFR的激活
　　為了進(jìn)一步證明Nox4過表達(dá)對(duì)PTP1B功能的作用，我們檢測(cè)了對(duì)照組細(xì)胞和Nox4過表達(dá)細(xì)胞免疫沉淀的PTP1B的磷酸酶活性，發(fā)

32、現(xiàn)Nox4過表達(dá)抑制了PTP1B的活性。為了確定PTP1B活性的抑制是氧化還原敏感的，在所有樣品中加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT)，結(jié)果顯示Nox4對(duì)PTP1B活性的影響被DTT阻斷了。因?yàn)镻TP1B是VEGF受體(VEGFR)信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，我們檢測(cè)了vNox4和PTP1B抑制劑是否調(diào)節(jié)VEGFR2的磷酸化水平。免疫沉淀檢測(cè)結(jié)果提示抑制PTP1B或者過表達(dá)Nox4均能增加VEGFR2的磷酸化。
　　結(jié)論：
　　1.過表

33、達(dá)外源性Nox4具有抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用
　　2.Akt信號(hào)通路而非ERK1/2參與了Nox4的抗凋亡作用
　　3.PTPs抑制Akt通路的激活
　　4.過表達(dá)外源性Nox4通過抑制PTP1B的活性進(jìn)而激活VEGFR
　　第三部分：氧化還原信號(hào)通路在TGF-β調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)脈表型分化中的作用及分子機(jī)制
　　研究背景：
　　細(xì)胞分化不僅是心血管的胚胎發(fā)育中一個(gè)重要的過程，而且在成年期也同樣具有維持血管系

34、統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)脈和靜脈表型的錯(cuò)誤界定會(huì)對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育和功能造成嚴(yán)重的后果，比如在胚胎發(fā)育中的缺陷和死亡，另外還有動(dòng)靜脈畸形(AVM)。AVM是遺傳性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(HTT)的一個(gè)重要特點(diǎn)，而且腦動(dòng)靜脈畸形是導(dǎo)致年輕人顱內(nèi)出血性中風(fēng)的主要原因。人類和小鼠基因研究表明TGF-β信號(hào)通路在毛細(xì)血管新生中發(fā)揮重要作用，TGF-β信號(hào)通路組成成分的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠因?yàn)檠苋毕荻咛ニ劳觥Ｒ酝芯堪l(fā)現(xiàn)TGF-β受體endoglin（T

35、GF-β的輔助受體）或ALK1受體的缺失會(huì)導(dǎo)致類似于動(dòng)靜脈畸形血管異常的血管病理學(xué)改變，與HHT有關(guān)，這種病理變化往往伴隨內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)靜脈特異性的紊亂。
　　間接的研究證據(jù)提示TGF-β信號(hào)通路或許參與了內(nèi)皮細(xì)胞表型的特異性分化。在發(fā)育中，內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)脈和靜脈的特異性分化是受嚴(yán)格轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。某些細(xì)胞的標(biāo)志物，比如酪氨酸激酶受體EphB4和其配體EphrinB2在細(xì)胞中特異性表達(dá)，EphrinB2主要在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)而EphB4主要

36、在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，這一對(duì)配體-受體被認(rèn)為分別是動(dòng)脈型內(nèi)皮細(xì)胞和靜脈型內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。
　　靜脈表型被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞分化中的缺省狀態(tài)，而Notch信號(hào)通路的激活（在VEGFA和sonichedgehog的下游）注定細(xì)胞向動(dòng)脈表型分化。進(jìn)化上高度保守的Notch信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)4種Notch受體(Notch1-4)和5種Notch配體(Jagged1、2，DLL1、3、4)，研究顯示Notch信號(hào)通路在決定動(dòng)脈細(xì)胞表型

37、中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞膜上的Notch配體與相鄰細(xì)胞的受體結(jié)合，引起γ-分泌酶剪切跨膜受體形成Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，然后NICD從原來的受體上釋放轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的NICD與DNA結(jié)合蛋白CSL(RBP-Jκ/CBF1)和共同激活因子Mastermind-like(MAML)結(jié)合，激活下游靶基因HES和HEY家族的轉(zhuǎn)錄。
　　有意思的是，越來越多的證據(jù)提示ROS介導(dǎo)的信號(hào)途徑在干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化中是一個(gè)重要的

38、調(diào)節(jié)因子。但是，ROS在內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)靜脈分化中的作用還知之甚少，因此，我們的研究的目的是探究TGF-β的氧化還原調(diào)節(jié)作用在內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)脈和靜脈表型特異性變化中的潛在作用。
　　研究目的：
　　1.TGF-β對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)靜脈標(biāo)志物的影響
　　2.TGF-β是否對(duì)Notch信號(hào)通路有作用
　　3.氧化還原信號(hào)通路是否參與了TGF-β引起的內(nèi)皮細(xì)胞表型變化
　　研究方法：
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA

39、表達(dá)
　　TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Taqman探針-引物體系或SYBRGreen法進(jìn)行PCR，GAPDH或18S作為管家基因檢測(cè)mRNA表達(dá)的相對(duì)變化。
　　2.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后用一抗、二抗孵育。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶，LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。
　

40、　3.細(xì)胞免疫熒光法
　　生長(zhǎng)于Lab-Tek腔室玻片上的細(xì)胞處理后固定，加一抗和熒光二抗孵育，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡拍照。
　　4.細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白的分離提取
　　收集處理的內(nèi)皮細(xì)胞，提取細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，進(jìn)行western blot的后續(xù)操作，檢驗(yàn)NICD的核轉(zhuǎn)位情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)

41、計(jì)分析，非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.TGF-β刺激HUVECs表達(dá)動(dòng)脈標(biāo)志物
　　TGF-β上調(diào)動(dòng)脈標(biāo)志物EphrinB2的表達(dá)，而對(duì)靜脈標(biāo)志物EphB4的mRNA水平?jīng)]有顯著作用。TGF-β沒有顯著影響EphrinB2的蛋白水平。
　　2.TGF-β增加Notch受體和配體及靶基因的表達(dá)
　　檢測(cè)不同Notch信

42、號(hào)通路基因表達(dá)譜的變化，包括Notch受體(Notch1和Notch4)、Notch配體（Jagged1和DLL4）和Notch的靶基因(HEY1)，結(jié)果顯示TGF-β增加上述Notch信號(hào)通路標(biāo)志物的表達(dá)。我們又用westernblot驗(yàn)證了TGF-β對(duì)DLL4、Notch1和Jagged1的蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果與基因表達(dá)相似。
　　3.TGF-β增加NICD的表達(dá)和促進(jìn)核轉(zhuǎn)位
　　TGF-β處理增加了NICD的蛋白表達(dá)

43、，并且用免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡的方法證明TGF-β引起NICD的核轉(zhuǎn)位，提示TGF-β激活了Notch信號(hào)通路。
　　4.TGF-β未影響HMVECs的動(dòng)靜脈標(biāo)志物的表達(dá)
　　研究結(jié)果顯示TGF-β對(duì)動(dòng)脈標(biāo)志物表達(dá)的影響是細(xì)胞特異性的，因?yàn)槲覀儾]有觀察到TGF-β對(duì)HMVECs的EphrinB2、EphB4、Notch1、Notch4、Jagged1或HEY1的表達(dá)有明顯影響。
　　5.TGF-β增加動(dòng)脈標(biāo)志物的表

44、達(dá)是氧化還原依賴的
　　在NAC存在的條件下，TGF-β與對(duì)照組相比，對(duì)動(dòng)脈標(biāo)志物表達(dá)沒有顯著的作用。我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用外源性H2O2模擬了TGF-β對(duì)動(dòng)脈標(biāo)志物表達(dá)的作用。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染了慢病毒Nox4shRNA的內(nèi)皮細(xì)胞中，TGF-β對(duì)Notch1、Jagged1、HEY1和EphrinB2表達(dá)的影響減弱了。
　　結(jié)論：
　　1.TGF-β細(xì)胞特異性刺激HUVECs向動(dòng)脈表型轉(zhuǎn)化
　　2.TGF-β激活N