外膜中NADPH氧化酶在移植性血管病中的作用.pdf

1、移植性血管?。╰ransplant vasculopathy,TV）是一種以移植物血管新內(nèi)膜形成為主要特點(diǎn)的增殖性血管疾病。器官移植后90％的患者在10年內(nèi)發(fā)展成TV。近年來(lái)，隨著免疫抑制劑的發(fā)展和應(yīng)用，器官移植后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生得到較好的控制，而器官移植后以移植性血管病為主要表現(xiàn)的慢性排斥反應(yīng)成為影響移植物長(zhǎng)期存活的主要因素。如何有效地減輕移植后血管損傷和提高移植物的長(zhǎng)期存活率，是目前器官移植領(lǐng)域的重要課題。TV的血管內(nèi)膜增生是人們

2、一直關(guān)注的焦點(diǎn)，關(guān)于其發(fā)生機(jī)制的研究多數(shù)都集中在血管中膜平滑肌細(xì)胞的增殖并向內(nèi)膜遷移，以及血管壁炎細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷并分泌多種細(xì)胞因子，從而促使血管內(nèi)膜增厚繼而發(fā)生血管腔狹窄。而血管外膜一直被認(rèn)為是對(duì)血管起營(yíng)養(yǎng)和支持作用的一層結(jié)締組織，未引起人們的足夠重視。
　　近些年來(lái)，研究者開始關(guān)注血管外膜的作用，并發(fā)現(xiàn)外膜在動(dòng)脈粥樣硬化形成、動(dòng)脈球囊損傷等病變中發(fā)揮重要作用。并有研究證明，當(dāng)血管受到細(xì)胞因子和牽拉、機(jī)械損傷等刺激后，外膜

3、的成纖維細(xì)胞可以被激活，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移能力增強(qiáng)等改變，參與了血管的重構(gòu)。說(shuō)明血管外膜在涉及血管重塑的疾病中有重要作用。
　　另外，NADPH氧化酶在心血管疾病中的重要作用已有很多報(bào)道，如動(dòng)脈粥樣硬化病灶的形成和發(fā)展與NADPH氧化酶的活性密切相關(guān)。而且有研究者證明，NADPH氧化酶參與外膜成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而使外膜成纖維細(xì)胞被激活，繼而誘導(dǎo)血管重塑的發(fā)生。
　　然而，NADPH氧化酶在血管外膜中的表達(dá)以及如何

4、在外膜中發(fā)揮作用，引起移植性血管病的發(fā)生、發(fā)展，少有人研究。本課題主要就外膜中NADPH氧化酶、外膜炎癥及外膜血管新生對(duì)血管重構(gòu)的作用進(jìn)行探討和研究。
　　研究目的:
　　建立大鼠胸-腹主動(dòng)脈移植模型，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證移植性血管病起始于外膜的激活，外膜成纖維細(xì)胞中NADPH氧化酶在蛋白和mRNA水平上的高表達(dá)，促進(jìn)了外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移能力的變化，探討血管外膜以及外膜成纖維細(xì)胞激活在移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展中的作用

5、及外膜炎癥和新生血管的生成對(duì)新生內(nèi)膜可能的促進(jìn)作用。
　　研究方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取F344雄性大鼠的胸主動(dòng)脈為供體血管，用袖套管技術(shù)移植到Lewis雄性大鼠腹主動(dòng)脈建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停浦惭茏鳛閷?shí)驗(yàn)組，未移植F344雄性大鼠胸主動(dòng)脈作為正常對(duì)照組。移植實(shí)驗(yàn)組于血管移植后0.5，3，7，14天，分別取出移植的胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色，測(cè)量移植血管的內(nèi)膜、中膜、外膜增生情況及內(nèi)膜/中膜厚度比值。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p47phox和g

6、p91phox及CD68和CD3的表達(dá)。分離血管外膜組織，用QRT-PCR方法在mRNA水平上檢測(cè)移植實(shí)驗(yàn)組0.5，3，7，14天各時(shí)間點(diǎn)血管外膜gp91phox和p47phox的表達(dá)。
　　體外實(shí)驗(yàn):分離雄性F344胸主動(dòng)脈外膜及F344-Lewis移植14天血管外膜成纖維細(xì)胞分別做原代培養(yǎng)。取原代細(xì)胞培養(yǎng)的3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。比較兩種細(xì)胞增殖和遷移能力的差別;QPCR比較兩種原代成纖維細(xì)胞的p47phoxmRNA的表達(dá)水平。

7、p47phox-siRNA特異性敲除p47phox后觀察細(xì)胞功能的變化:將移植14天血管外膜原代成纖維細(xì)胞分成三組，空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組），陰性對(duì)照組及p47phox-siRNA轉(zhuǎn)染組，對(duì)三組細(xì)胞分別進(jìn)行Brdu染色檢測(cè)細(xì)胞增殖、transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;Diapocynin抑制NADPH氧化酶后觀察細(xì)胞功能的變化:移植14天血管外膜原代成纖維細(xì)胞分成空白組，DMSO組（對(duì)照組）及Diapocynin組，CCK-8檢測(cè)

8、三組細(xì)胞增殖能力，transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　研究結(jié)果:
　　1.移植血管外膜增生先于新內(nèi)膜形成HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，移植血管組各時(shí)間點(diǎn)的外膜從3天開始明顯增厚，7天繼續(xù)增厚，14天增厚更為明顯;內(nèi)膜從7天開始增厚，14天增厚明顯;而中膜的厚度在0.5天、3天、7天、14天各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異。
　　2.移植血管外膜中NADPH氧化酶的表達(dá)上調(diào)免疫組化結(jié)果顯示，gp91phox與p

9、47phox的陽(yáng)性細(xì)胞最早出現(xiàn)在移植后3天的動(dòng)脈外膜，并隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增多;移植后7天內(nèi)膜開始出現(xiàn)gp91phox與p47phox的陽(yáng)性細(xì)胞，14天繼續(xù)增多。QPCR結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較，移植血管外膜的gp91phox和p47phox的mRNA的表達(dá)水平從3天開始隨著移植天數(shù)的延長(zhǎng)而逐漸增高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.移植血管外膜中炎細(xì)胞的浸潤(rùn)單核-巨噬細(xì)胞移植后3天即在外膜中出現(xiàn)，7天和14天隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多;單核-巨

10、噬細(xì)胞在移植后7天出現(xiàn)在內(nèi)膜，14天較7天增多。T細(xì)胞數(shù)在血管移植后隨移植天數(shù)的延長(zhǎng)無(wú)顯著差異。
　　4.抑制移植血管外膜成纖維細(xì)胞中NADPH氧化酶表達(dá)，細(xì)胞增殖遷移能力下降移植14天血管外膜原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染p47phox-siRNA和Diapocynin干預(yù)，細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯受到抑制。
　　5.血管外膜中新生血管形成與新內(nèi)膜形成相關(guān)移植后3天血管外膜中未發(fā)現(xiàn)新生血管，移植后7天新生血管開始出現(xiàn)，14天明顯增多