小膠質(zhì)細(xì)胞在DAI后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶激活中的作用及對(duì)機(jī)體交感活性的影響.pdf

1、重型顱腦損傷有較高的死亡率和致殘率。重型顱腦損傷昏迷的部分患者中會(huì)出現(xiàn)過度的陣發(fā)性交感神經(jīng)興奮(Paroxysmal sympathetic hyperactivity，PSH)癥狀，主要表現(xiàn)為:周期性發(fā)作的高血壓、心動(dòng)過速、呼吸急促、發(fā)熱、出汗和肌張力障礙，并最終導(dǎo)致顱外器官的功能衰竭，不僅給重型顱腦損傷患者的處理帶來極大困難，亦可直接增加致死率和致殘率。但是人們對(duì)它的發(fā)病機(jī)制和病理生理變化尚無充分的認(rèn)識(shí)，這給臨床治療帶來巨大困難。研

2、究發(fā)現(xiàn)頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(Rostral ventrolatera1medulla，RVLM)是交感興奮輸出的重要中樞和出口，RVLM內(nèi)氧化應(yīng)激是機(jī)體交感興奮和神經(jīng)源性高血壓的重要病理生理基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究表明還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH)氧化酶是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，NOX2(gp91 phox)是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要亞基，

3、顱腦損傷后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶表達(dá)增加使氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生過多，最終可導(dǎo)致機(jī)體交感興奮的產(chǎn)生。雖然有研究顯示顱腦損傷后部分腦區(qū)（大腦皮層、海馬和矢狀竇旁腦組織等）的小膠質(zhì)細(xì)胞激活可引起NADPH氧化酶表達(dá)增加。但是到目前為止，尚未見關(guān)于顱腦損傷后RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的研究報(bào)道。小膠質(zhì)細(xì)胞激活與顱腦損傷后機(jī)體交感興奮之間的關(guān)系尚不清楚。為明確RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活在顱腦損傷后交感興奮中的作用及其發(fā)生機(jī)理，本文利用彌漫性軸索損傷（

4、Diffuse axonalinjury，DAI）模型，探討了小膠質(zhì)細(xì)胞激活在DAI后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶激活中的作用及對(duì)機(jī)體交感活性的影響，為PSH治療提供新的思路。
　　一、大鼠彌漫性軸索損傷后RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況
　　目的:
　　1、探索DAI后RVLM內(nèi)是否存在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活;
　　2、明確小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑米諾環(huán)素對(duì)DAI后RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。
　　方法:
　　

5、250g-300g成年健康雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只、DAI組36只、DAI+米諾環(huán)素48 h組12只。DAI組和DAI+米諾環(huán)素48h組大鼠建立彌漫性軸索損傷模型。再將DAI組存活大鼠按24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)分為三個(gè)亞組，并且保證每個(gè)亞組至少6只大鼠存活。DAI+米諾環(huán)素48 h組也要保證至少有6只大鼠存活。其中，DAI+米諾環(huán)素48h組分別在致傷前4h和致傷后4h、8h、12h經(jīng)尾靜脈向大鼠體內(nèi)

6、注射米諾環(huán)素10 mg/kg。在DAI后24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取RVLM區(qū)域腦組織做石蠟切片，利用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1，了解RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，以及米諾環(huán)素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。
　　結(jié)果:
　　1、DAI后24 h至72 h，可發(fā)現(xiàn)RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，較正常對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);
　　2、米諾環(huán)素能夠明顯抑制傷后48h大

7、鼠RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，較同期DAI組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、DAI后RVLM內(nèi)有小膠質(zhì)細(xì)胞的明顯激活，且72h內(nèi)逐漸增強(qiáng);
　　2、小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑米諾環(huán)素對(duì)DAI后RVLM內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活有明顯抑制作用。
　　二、大鼠彌漫性軸索損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞在RVLM內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)激活中的作用
　　目的:
　　1、研究大鼠DAI后RVLM內(nèi)是否有NADPH氧化酶亞

8、基NOX2(gp91 phox)表達(dá)的增加;
　　2、研究小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑米諾環(huán)素是否可使DAI后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶亞基NOX2(gp91 phox)的表達(dá)下調(diào)或抑制;
　　3、根據(jù)上述研究結(jié)果，明確小膠質(zhì)細(xì)胞在DAI后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)激活中的作用。
　　方法:
　　250g-300g成年健康雄性SD大鼠78只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只、DAI組36只以及DAI+米諾環(huán)素組36只。DAI組

9、和DAI+米諾環(huán)素組大鼠建立彌漫性軸索損傷模型。再將DAI組和DAI+米諾環(huán)素組存活大鼠按24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)分為三個(gè)亞組，并且保證每個(gè)亞組至少6只大鼠存活。其中DAI+米諾環(huán)素組分別在致傷前4h和致傷后4h、8h、12h分別以米諾環(huán)素10mg/kg經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)。傷后24h、48h、72h，取大鼠全腦冰凍保存。利用Western-blot技術(shù)檢測(cè)RVLM內(nèi)NADPH酶亞基NOX2(gp91 phox)表

10、達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、DAI組RVLM內(nèi)NOX2(gp91 phox)的表達(dá)明顯增高，傷后呈上升趨勢(shì)，各亞組較正常對(duì)照組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);
　　2、DAI+米諾環(huán)素組24h和48h NOX2(gp91phox)的表達(dá)明顯低于DAI組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);DAI+米諾環(huán)素組72h NOX2(gp91 phox)的表達(dá)與DAI組72h相比，雖有減低，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

11、P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠RVLM內(nèi)NOX2(gp91phox)的表達(dá)在DAI后有顯著增加;
　　2、小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑米諾環(huán)素對(duì)大鼠DAI后RVLM內(nèi)NOX2(gp91 phox)的表達(dá)有顯著抑制作用;
　　3、隨著米諾環(huán)素在大鼠體內(nèi)的代謝，對(duì)NOX2(gp91phox)表達(dá)的抑制作用也逐漸減弱;
　　4、小膠質(zhì)細(xì)胞在DAI后RVLM內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)的激活中起重要作用。
　　

12、三、大鼠彌漫性軸索損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)機(jī)體交感興奮性的影響
　　目的:
　　1、探索大鼠DAI后交感興奮性（血壓、心率）變化情況;
　　2、明確小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑米諾環(huán)素是否可降低DAI后機(jī)體交感興奮性，探索小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)DAI后機(jī)體交感活性的影響。
　　方法:
　　250g-300g成年健康雄性SD大鼠104只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只、DAI組48只、DAI+米諾環(huán)素組48只。DAI組和DAI+米諾

13、環(huán)素組大鼠建立彌漫性軸索損傷模型。再將DAI組和DAI+米諾環(huán)素組存活大鼠按24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)分為三個(gè)亞組，并且保證每個(gè)亞組至少8只大鼠存活。DAI+米諾環(huán)素組在致傷前4h和致傷后4h、8h、12h分別以米諾環(huán)素10mg/kg經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)。傷后24h、48h和72h通過股動(dòng)脈置管連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓和心率2h，并利用MPA多道生物分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析大鼠血壓、心率。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠DAI后2

14、4h、48h、72h，交感興奮性（血壓分別為:133.17±4.70mmHg、138.78±4.52 mmHg、142.30±4.09mmHg;心率分別為:407.09±9.89次/分、417.73±12.29次/分、459.06±9.85次/分）呈上升趨勢(shì)，較正常對(duì)照組（血壓:116.64±6.28mmHg;心率:373.84±11.25次/分）有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);
　　2、小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素對(duì)大鼠DAI后交

15、感興奮性增加有抑制作用，24h（血壓:124.09±5.36mmHg;心率:395.96±9.17次/分）最明顯，與DAI24h相比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;48h（血壓:135.11±2.99mmHg;心率:409.50±11.0次/分）和72h（血壓:140.20±4.27mmHg;心率:453.46±10.72次/分）雖也有交感興奮性降低的變化趨勢(shì)，但與DAI48h和72h相比，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠D