Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎腎臟纖維化中的作用及其干預研究.pdf

1、背景：
　　狼瘡性腎炎(Lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupuserythematosus，SLE)最常見的并發(fā)癥，最終進展為終末期腎臟病(End-stage renaldisease，ESRD)，而腎臟纖維化則是各種慢性腎臟病(Chronic kindey disease，CKD)的共同最終通路。在腎臟纖維化的過程中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal tr

2、ansition，EMT)是腎臟產(chǎn)生大量纖維細胞和肌成纖維細胞及基質(zhì)沉積的重要途徑。LN過程中大量自身抗體及免疫復合物的形成可造成腎臟的氧化應激損傷，產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，可誘導腎小管間質(zhì)發(fā)生EMT進而促進腎臟纖維化。NADPH氧化酶(Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH Oxidase)系統(tǒng)是ROS的主要來源，其中Nox4

3、是腎小管上皮細胞表達的主要類型，但Nox4來源的ROS是否參與腎小管上皮細胞發(fā)生EMT尚未可知。研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡上皮細胞中，E3泛素連接酶Cb1-c可啟動泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome system，UPS）促進Nox4的降解延緩肺的纖維化，但目前Cb1-c在腎臟是否能發(fā)揮類似作用尚無相關(guān)研究。本研究旨在探討Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎腎臟纖維化中的作用以及泛素化降解Nox4的干預作用。
　

4、　目的：
　　探討Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎(LN)腎小管上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及其干預研究，為狼瘡性腎炎腎間質(zhì)纖維化的機制研究和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.收集2014年1月-2015年8月河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科收治并行腎活檢病理檢查確診為LN的患者31例，取其腎穿刺組織作為實驗組，另取3例腎臟腫瘤患者的瘤旁組織作為正常對照組，應用免疫熒光法檢測所有腎臟組織標本中腎小管間質(zhì)內(nèi)Nox

5、4型NADPH氧化酶(Nox4)、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)的表達情況并進行半定量分析。
　　2.以抗ds-DNA抗體刺激人腎小管上皮細胞(HK-2)模擬狼瘡性腎炎(LN)的過程，將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞分為以下4組:(1)正常對照組(10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基)，(2)抗體組（10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基+100ug/ml抗ds-DNA抗體），(3)空轉(zhuǎn)組（10％FBS的DMEM-F

6、12培養(yǎng)基+Cb1-c cDNA轉(zhuǎn)染），(4)轉(zhuǎn)染+抗體組（10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基+Cb1-c cDNA轉(zhuǎn)染+100ug/ml抗ds-DNA抗體）。給藥72h后，對以上各組細胞進行以下檢測:①采用MTT法檢測細胞的增殖情況;②酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)水平;③采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞的活性氧(ROS)水平;④采用Western印跡法檢測各組細胞的Nox4蛋白、鈣

7、粘附蛋白(E-cadherin)、α-SMA蛋白、FN蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.腎臟組織免疫熒光結(jié)果顯示，LN患者腎臟組織的小管上皮處有微弱表達的Nox4，在腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)內(nèi)可見大量α-SMA、FN的表達，且其表達量與LN的病理類型相關(guān)，病理類型為Ⅱ型的表達量相對較少，Ⅳ型相對較多;而正常對照組中，均無相應目的蛋白的表達。
　　2.1.抗ds-DNA抗體培養(yǎng)一定時間后，HK-2細胞的增殖活力降低，

8、鏡下察到細胞形態(tài)由多邊形變化為梭形，細胞間隙增大;而轉(zhuǎn)染+抗體組中HK-2細胞的增殖活力較抗體組有所增加?？筪s-DNA抗體還能誘導腎小管上皮細胞產(chǎn)生大量TGF-β1，而轉(zhuǎn)染+抗體組中的TGF-β1較抗體組無明顯改變，提示狼瘡性腎炎中可產(chǎn)生大量促纖維化因子TGF-β1，而過表達Cb1-c對TGF-β1的分泌無特殊作用。
　　2.2.抗ds-DNA抗體培養(yǎng)一定時間后，HK-2細胞的Nox4蛋白水平較對照組明顯上調(diào)，ROS水平顯著增高

9、，提示狼瘡性腎炎中Nox4型NADPH氧化酶的表達上調(diào)可促進ROS的生成。Cb1-c轉(zhuǎn)染可顯著降低Nox4的表達;與抗體組相比，轉(zhuǎn)染+抗體組中HK-2細胞的Nox4蛋白水平和ROS的生成均明顯降低，提示促進Nox4型NADPH氧化酶的降解可有效減少ROS的產(chǎn)生。
　　2.3.與對照組相比，抗體組中腎小管上皮細胞的間質(zhì)細胞標志物α-SMA蛋白、FN蛋白水平顯著增高，上皮細胞標志物E-Cadherin蛋白水平明顯降低;而與抗體組相比，

10、轉(zhuǎn)染+抗體組中的α-SMA蛋白、FN蛋白水平明顯降低，E-Cadherin蛋白水平有所增高。這提示狼瘡性腎炎中的腎小管上皮細胞可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)，且與Nox4型NADPH氧化酶的活化密切相關(guān)，而促進Nox4的降解可顯著抑制EMT的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.狼瘡性腎炎中Nox4型NADPH氧化酶/ROS氧化應激通路的激活，可促使腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，導致腎臟纖維化的發(fā)生。
　　2.泛素化降解