硒半胱氨酸解碼相關(guān)因子RPL30、SBP2和EFsec在硒蛋白P高效表達(dá)中作用研究.pdf

1、目的：
　　克隆RPL30、SBP2和EFsec三個反式作用因子基因，并構(gòu)建其哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，然后與重組質(zhì)粒pcDNA3.1-iGFP-Sepp1共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，研究三個反式作用因子對硒蛋白P基因表達(dá)的影響。為實現(xiàn)硒蛋白P在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　應(yīng)用RT-PCR方法從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中擴增RPL30基因，利用雙酶切法將其連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）；采用半合成-

2、酶連法EFsec基因中所缺失的片段補齊，用PCR方法擴增拼接產(chǎn)物，將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）；真核表達(dá)載體pCMV-XL4-SBP2購自O(shè)riGene生物公司；將三個反式作用因子表達(dá)質(zhì)粒與硒蛋白P表達(dá)質(zhì)粒按照不同的組合方式，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；采用RT-PCR法檢測三個反式作用因子的表達(dá)及其對硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　結(jié)果：
　　成功克隆RPL30基因并構(gòu)建其表達(dá)載體pcDNA

3、3.1-RPL30；準(zhǔn)確地將EFsec-基因補齊了其5′端缺失的基因序列，并成功地構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1-EFsec；RT-PCR方法聯(lián)合條帶平均密度值分析證實，轉(zhuǎn)染組與正常組相比，目的基因RPL30、SBP2和EFsec的mRNA水平顯著增高，表明轉(zhuǎn)染成功并有效表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的成功構(gòu)建以及其超表達(dá)后對硒蛋白P基因轉(zhuǎn)錄水平的作用分析，為深入