茶樹(shù)葉片中硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平的研究.pdf

1、硒是人體最重要的微量元素。硒在人體內(nèi)最主要的生理功能是抗氧化作用；硒還可以改善免疫功能，提高抵抗力。美國(guó)醫(yī)學(xué)家稱硒是至今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)烈也最具潛力的抗癌營(yíng)養(yǎng)素。據(jù)地質(zhì)學(xué)家考證：我國(guó)72％的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。為提高硒營(yíng)養(yǎng)水平，有專家推薦，應(yīng)以增加膳食硒為主。茶葉是我國(guó)最受歡迎的飲品，而且茶葉中的硒含量比一般食品要高，可以通過(guò)富硒茶的形式補(bǔ)充人體的硒營(yíng)養(yǎng)。硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Selenocysteine methyltransferase，SM

2、T）是植物體內(nèi)硒代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。已經(jīng)有學(xué)者通過(guò)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中高表達(dá)黃芪（Astragalus bisulcatus）的SMT基因從而獲得了高積累硒的擬南芥植株。而關(guān)于茶樹(shù)硒代謝方面的研究比較少。目前生產(chǎn)富硒茶的方式主要是在富硒土壤上種植茶樹(shù)。能否通過(guò)改變SMT的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平從而進(jìn)一步提高富硒地區(qū)茶樹(shù)硒的含量，使低硒地區(qū)的茶樹(shù)可以生產(chǎn)富硒茶，仍舊是一個(gè)疑問(wèn)。本實(shí)驗(yàn)就是研究在富硒與非富硒環(huán)境

3、下生長(zhǎng)的同一品種茶樹(shù)--祁門(mén)櫧葉種（Camellia sinensis Qimen-chuyezhong）的硒含量與SMT之間的關(guān)系，從而了解能否通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法從根本上解決茶樹(shù)富硒的問(wèn)題，也可以此為參考，研究非高積累硒植物的硒代謝途徑。
　　 本文以CTAB-LiCl法提取龍井43（C. sinensis cv Longjing43）葉片總RNA，根據(jù)茶樹(shù)α-微管蛋白（α-tubulin）的mRNA全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)

4、DQ340766）設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得α-tubulin cDNA全長(zhǎng)片段，并連接至pET-32a（+）載體，在大腸桿菌BL21trx B（DE3）菌株中得到大量表達(dá)。SMT原核表達(dá)菌株的構(gòu)建由本實(shí)驗(yàn)室朱林完成。
　　 這兩個(gè)表達(dá)菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，獲得大量融合蛋白，經(jīng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE，以切膠的方式制備抗原，免疫家兔獲得抗血清，經(jīng)特異性吸附純化后獲得了特異性抗體。以采自安

5、徽石臺(tái)富硒土壤和非富硒土壤的祁門(mén)櫧葉種嫩葉和老葉為實(shí)驗(yàn)材料制備粗蛋白提取液，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，用制備的兩種抗體對(duì)其進(jìn)行Western blot，檢測(cè)SMT在不同的樣品中的表達(dá)情況。
　　 同時(shí)，以同樣的方法提取富硒茶與非富硒茶老葉與嫩葉的總RNA。以M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。分別設(shè)計(jì)SMT和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH）

6、的特異性引物，并摸索各引物最適合的PCR條件以及各基因的平臺(tái)期。以上述四個(gè)樣品的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用軟件分析各條帶的灰度值，研究SMT在不同樣品中的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了茶樹(shù)α-tubulin的原核表達(dá)載體，并且制備獲得了茶樹(shù)α-tubulin和SMT的特異性抗體。經(jīng)過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)和半定量PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在同一生長(zhǎng)階段，SMT基因在富硒茶葉和非富硒茶葉中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平