一株海洋來源鏈格孢聚酮合酶及真菌非還原型聚酮合酶PT結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)研究.pdf

1、真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能復雜多樣的聚酮化合物，由巨大的、多結(jié)構(gòu)域的聚酮合酶合成。大部分真菌聚酮合酶屬于多結(jié)構(gòu)域單一模塊化的Ⅰ型聚酮合酶，依據(jù)功能和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可分為非還原型(NR-PKS)，部分還原型(PR-PKS)和高度還原型(HR-PKS)，其催化β酮的還原程度、結(jié)構(gòu)域組成以及代謝化合物類型不同。其中，非還原型聚酮合酶催化非還原聚β酮鏈發(fā)生環(huán)化反應，形成單環(huán)或多環(huán)的芳香聚酮化合物。最近研究表明，真菌非還原型聚酮合酶家族中特有的PT結(jié)構(gòu)

2、域，控制聚酮化合物主鏈環(huán)化反應的區(qū)域選擇性，并決定了產(chǎn)物的最終結(jié)構(gòu)。當前，應用組合生物合成方法研究聚酮化合物生合成途徑，通過操作聚酮合酶提高化合物產(chǎn)量或獲得新化合物及高活性化合物，是化學生物學研究的熱點。本實驗室前期分離出一株肉芝軟珊瑚來源的共附生真菌鏈格孢Alternariaalternata M311B，其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，大多為聚酮化合物，其中的蒽醌類、苯醌類化合物顯示很強的化學生態(tài)作用和藥理活性。本研究運用分子生物學方法獲得M3

3、11B聚酮合酶序列，在運用生物信息學方法系統(tǒng)分析真菌聚酮合酶序列、結(jié)構(gòu)與功能基礎上，預測M311B聚酮合酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、功能位點以及序列與產(chǎn)物的關(guān)系，以期為M311B聚酮合酶的組合生物合成研究提供基礎資料。
　　M311B聚酮合酶序列的獲得
　　通過簡并引物的方法，克隆得到8條M311B聚酮合酶序列。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將8條M311B聚酮合酶序列分類，其中M311B聚酮合酶PksA和PksI分類為真菌非還原型聚酮合酶，為首次

4、在鏈格孢中分類得出非還原型聚酮合酶。推測M311B聚酮合酶PksA和PksI與M311B苯醌類、蒽醌類化合物的合成相關(guān)，M311B高度還原型聚酮合酶PksJ參與M311B分離的化合物中格鏈孢酚和4-甲氧基格鏈孢酚的生合成。
　　真菌非還原型聚酮合酶PT結(jié)構(gòu)域序列、結(jié)構(gòu)與功能生物信息學系統(tǒng)分析
　　由于M311B苯醌類、蒽醌類化合物的生合成應與非還原型聚酮合酶相關(guān)，而PT結(jié)構(gòu)域作為非還原型聚酮合酶的重要功能域，控制了聚酮化合物

5、主鏈環(huán)化反應的區(qū)域選擇性，決定了產(chǎn)物的最終結(jié)構(gòu)，分析PT結(jié)構(gòu)域，將對從M311B聚酮合酶序列預測化合物結(jié)構(gòu)類型，以及通過生合成修飾改造聚酮化合物結(jié)構(gòu)都具有重要作用。從而，本研究基于大數(shù)據(jù)挖掘，對真菌非還原型聚酮合酶，尤其對其PT結(jié)構(gòu)域進行了序列、結(jié)構(gòu)、功能的系統(tǒng)分析。
　　分析當前數(shù)據(jù)庫中所有的共計661條真菌非還原型聚酮合酶的PT結(jié)構(gòu)域，探討其序列、結(jié)構(gòu)、功能之間的聯(lián)系?；谙到y(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)域組成分析，所有661條非還原型聚酮合酶

6、可被分為主要的8種亞型（亞型Ⅰ-Ⅷ），其中亞型Ⅷ為首次發(fā)現(xiàn)。PT結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與非還原型聚酮合酶全長氨基酸序列基本一致，分別將亞型Ⅰ-Ⅷ的PT結(jié)構(gòu)域與環(huán)化方式（C2-C7，C4-C9，C6-C11）和合成的化合物相聯(lián)系。使用三種比較蛋白質(zhì)模建方法，分別模建各亞型PT結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，并在原子水平對模建的三維結(jié)構(gòu)進行動力學優(yōu)化。質(zhì)量評估結(jié)果說明所有模建PT蛋白結(jié)構(gòu)的準確性都是可以接受的。分析顯示所有亞型催化腔中大部分的圍腔位點是一致

7、的，是區(qū)域性的圍腔位點突變產(chǎn)生了不同朝向的指形區(qū)。在不同亞型中，催化腔形狀和體積、催化對位置等因素與環(huán)化區(qū)域選擇性和化合物大小相對應。在PT結(jié)構(gòu)域序列中，由保守氨基酸殘基負責環(huán)化功能，而關(guān)鍵氨基酸殘基的進化，改變了PT催化腔的大小和形狀，從而導致環(huán)化功能的分化。以上研究闡明了真菌聚酮合酶PT結(jié)構(gòu)域的序列、結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，能夠更好的理解PT結(jié)構(gòu)域的環(huán)化機制，指導通過非還原型聚酮合酶序列預測化合物結(jié)構(gòu)類型，并幫助指導真菌聚酮合酶的組合

8、生物合成操作，調(diào)控生合成途徑獲得目標代謝產(chǎn)物。
　　M311B聚酮合酶結(jié)構(gòu)域序列、結(jié)構(gòu)與功能預測
　　在上述研究結(jié)果的基礎上，對獲得的M311B聚酮合酶進行功能分析。識別8條聚酮合酶結(jié)構(gòu)域組成，其中非還原型聚酮合酶PksA和PksI中SAT和PT結(jié)構(gòu)域，為首次對鏈格孢聚酮合酶SAT和PT結(jié)構(gòu)域的研究報道。通過PT結(jié)構(gòu)域的研究，推測M311B非還原型聚酮合酶PksA很可能通過C2-C7環(huán)化方式，合成化合物1，3，6，8-四羥基