三種藥用植物揚(yáng)子毛茛、石龍芮和臭靈丹的抗病毒研究.pdf

1、病毒是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的病原體。研究表明,有60％的疾病是由病毒感染引起的,而病毒感染性疾病已成為我國(guó)人口死亡的主要原因之一。新型病毒的不斷出現(xiàn),如人類(lèi)免疫缺陷病毒,非典型性肺炎病毒等,則對(duì)抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)提出更高的要求。病毒是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)病原體,其基本結(jié)構(gòu)是核酸和蛋白質(zhì)外殼,必須利用活細(xì)胞宿主的各種生物化學(xué)機(jī)制進(jìn)行復(fù)制。病毒的結(jié)構(gòu)、酶和復(fù)制機(jī)制均是抗病毒藥物的作用靶點(diǎn)。但目前臨床所用的抗病毒藥物存在著毒副作用大、作用不徹底等缺陷,因

2、此,開(kāi)發(fā)新型抗病毒藥物一直藥物研究的熱點(diǎn)之一。從植物中發(fā)現(xiàn)天然抗病毒藥物,是開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的重要途徑。特別是我國(guó)的傳統(tǒng)中醫(yī)藥和民族民間藥物,蘊(yùn)藏著豐富的寶藏,在發(fā)掘新型抗病毒有效物質(zhì)和天然藥物方面有著十分廣闊的前景。
　　本研究分兩部分,分別研究了揚(yáng)子毛茛和石龍芮抗乙型肝炎病毒,以及臭靈丹抗流感病毒和單純皰疹病毒的作用,從中發(fā)現(xiàn)了一些具有低毒高效的抗病毒化合物,為新型抗病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。第一部分、揚(yáng)子毛茛和石龍芮抗乙型肝炎

3、病毒研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前我國(guó)總?cè)丝诘?0%感染或既往感染過(guò)HBV,而慢性HBV感染人數(shù)占全世界慢性HBV感染人數(shù)的一半以上。目前臨床一線的抗HBV藥物有拉米夫定,干擾素等,這些藥物均存在毒副作用及耐藥性等問(wèn)題,所以開(kāi)發(fā)新型的抗HBV藥物已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外新藥研究的熱點(diǎn)。毛茛屬植物在我國(guó)資源豐富,產(chǎn)量大,一般具有小毒,有利濕退黃、溫寒止痛、散寒通滯

4、等功效,主要用于治療肝炎、黃疸、瘧疾、偏頭痛、胃痛、扁桃體炎等。現(xiàn)代藥理研究表明,毛茛屬植物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性。我們?cè)诜蛛x純化兩種毛茛屬植物-揚(yáng)子毛茛和石龍芮的化合物的基礎(chǔ)上，以
　　HepG2.2.15細(xì)胞為模型，測(cè)定從揚(yáng)子毛茛和石龍芮提取的共19種化合物的抗HBV活性。
　　樣品由本研究組植化室提供，分別為芹菜素．4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-

5、8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-c-β-D-半乳糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷、小麥黃素、木犀草素、東莨菪內(nèi)酯、馬栗樹(shù)皮素、濱蒿內(nèi)酯、阿魏酸、原兒茶酸、小毛茛內(nèi)酯、豆甾-4-烯-3,6-二酮、豆甾醇、二十烷酸、β-谷甾醇、6-羥基-甲氧基香豆素以及原兒茶醛。
　　藥物對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)：胰酶消化細(xì)胞，以1*105個(gè)/mL濃度接種96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5% CO2培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，換用10倍系列

6、稀釋的含藥培養(yǎng)液，每個(gè)樣品配制4種濃度，每濃度各3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。每4天換含樣品的培養(yǎng)基，第12天以MTT法測(cè)定樣品對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　藥物對(duì)HBV復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)：以lX105個(gè)/mL濃度接種96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，根據(jù)藥物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用IC10為最大實(shí)驗(yàn)濃度，共設(shè)3個(gè)劑量組，每濃度各3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照。每4天換含樣品的培養(yǎng)基，第12天收獲培養(yǎng)上清，同時(shí)測(cè)定乙型肝炎表面

7、抗原(Hepatitis surface antigen，HBsAg)，乙型肝炎e抗原(Hepatitis e antigen，HBeAg)及HBV-DNA。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-羥基-7-甲氧基香豆素對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg，HBeAg有不同程度的抑制作用，而在實(shí)驗(yàn)濃度下，拉米夫定則無(wú)明顯的抑制作用。
　　我們用定量PCR法測(cè)定了藥物作用后HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA濃度，結(jié)果顯示：芹菜

8、素-4- O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA的復(fù)制有不同程度的抑制作用，且隨樣品濃度增大其抑制作用增強(qiáng)。為了確證定量PCR試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們還用斑點(diǎn)雜交法測(cè)定有上述活性樣品處理的HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV-DNA，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上述4個(gè)樣品對(duì)HBV-DNA復(fù)制的抑制作用。
　　由于目前臨床

9、使用的一些抗病毒藥物對(duì)肝臟等重要器官有一定的毒副作用，而研究表明這是由于這些藥物對(duì)線粒體功能的抑制所致。因此，我們采用了多重PCR法測(cè)定樣品處理后HepG2.2.15細(xì)胞中線粒體高變區(qū)DNA和持家基因β-actin之間的比例，以此確定樣品對(duì)線粒體是否有抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，上述4個(gè)樣品對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞線粒體基因復(fù)制并無(wú)抑制作用，結(jié)果證實(shí)這些樣品的安全性。
　　綜上所述，我們測(cè)定了從揚(yáng)子毛茛和石龍芮中分離出的19種化合物的抗

10、HBV活性，結(jié)果表明芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-D-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-o-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素等4個(gè)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA的復(fù)制有著抑制作用，而6-羥基-7-甲氧基香豆素對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg，HBeAg的表達(dá)有一定的抑制作用。我們同時(shí)以臨床使用的拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照藥，實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA地復(fù)制有很強(qiáng)的抑

11、制作用，但對(duì)HBsAg，HBeAg表達(dá)基本無(wú)影響。
　　芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素等4個(gè)化合物均屬黃酮苷類(lèi)化合物，而黃酮苷類(lèi)化合物有著明顯的抗菌、抗病毒和保護(hù)心臟等作用。這些化合物抗HBV的作用機(jī)理還尚待研究，但從其對(duì)HBV作用效果和拉米夫定相比較，其都對(duì)HBV-DNA的復(fù)制有抑制作用，而對(duì)HBsAg，HBeAg表達(dá)基本無(wú)

12、影響，因此我們推測(cè)其抗HBV的機(jī)理有可能在于對(duì)DNA聚合酶的抑制作用。
　　總之，揚(yáng)子毛茛顯示出較強(qiáng)的抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的活性，有待于進(jìn)一步深入研究并開(kāi)發(fā)成治療乙型肝炎的藥物制劑。本研究首次證實(shí)了毛茛屬植物悠久的治療肝炎的藥用歷史的科學(xué)依據(jù)，揭示了揚(yáng)子毛莨抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第二部分、臭靈丹抗病毒研究
　　臭靈丹(Laggera pterodonta DC.Benth)為云南民間的常用中草藥，本品首

13、載于《滇南本草》“其味苦、辛、性寒，有毒。陰中之剛也，治風(fēng)熱積毒，臟腑不和。通行十二經(jīng)絡(luò)，發(fā)散瘡癰”。具有清熱解毒、消腫拔膿之功效。據(jù)現(xiàn)代研究資料表明，臭靈丹的主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)化合物、倍半萜類(lèi)化合物等，其具有祛痰和抗腫瘤的作用，用于流行性感冒、呼吸道感染、扁桃體炎、腮腺炎、口腔炎、咽喉炎、支氣管炎、瘧疾等疾病的治療。
　　本研究所用臭靈丹全草采自云南省騰沖縣，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所彭華教授鑒定為臭靈丹(Laggera pt

14、erodonta DC.Benth)，藥材存放中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所西南植物化學(xué)及植物資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No.200308LP)。
　　用熱水醇提法制備臭靈丹提取物，用三氯化鐵．鐵氰化鉀顯色法測(cè)定提取物中總酚含量，并用HPLC法測(cè)定提取物中異綠原酸含量。結(jié)果顯示，臭靈丹提取物中主要成分為酚類(lèi)物質(zhì)，總酚占提取物的53.0%，而異綠原酸占臭靈丹提取物的38%，為酚類(lèi)化合物中的主要成分。
　　細(xì)胞長(zhǎng)成單層的96孔板，棄去培養(yǎng)液

15、，加入100 TCIDso病毒液，37℃、5% C02下吸附2h，棄去病毒液，加入2倍連續(xù)稀釋的被試樣品，每濃度3孔，37℃、5% C02下培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，記錄病變程度（Cytopathic effect，CPE），計(jì)算樣品對(duì)病毒的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果表明，臭靈丹提取物及異綠原酸體外對(duì)l型單純皰疹病毒和、2型單純皰疹病毒和甲型人流感病毒均有較強(qiáng)的抑制作用，異綠原酸應(yīng)為臭靈丹提取物中抗病毒的主要活性成分。

16、
　　用雞胚法測(cè)定臭炅丹提取物對(duì)流感病毒的抑制作用，將不同稀釋度的藥液分別注射0.25 mL于雞胚中，半小時(shí)后經(jīng)相同途徑注射100 EIDso半數(shù)感染量的病毒0.1 mL，孵育5天。收集尿囊液，測(cè)其血凝效價(jià)滴度。結(jié)果表明，臭靈丹提取物濃度為10mg/胚劑量組對(duì)流感病毒有明顯的抑制作用。
　　以滴鼻法感染小鼠致小鼠流感病毒感染模型，并以此測(cè)定臭靈丹提取物對(duì)流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制作用，以及對(duì)流感病毒致小鼠病