三種核苷類抗病毒藥物對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的毒性研究.pdf

1、本試驗(yàn)通過建立大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，評(píng)價(jià)三種核苷類抗病毒藥物對(duì)原代大鼠肝細(xì)胞的毒性作用。 分別用膠原酶和胰酶灌流獲取大鼠肝細(xì)胞，通過臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力并計(jì)數(shù)，進(jìn)行原代培養(yǎng)并觀察其形態(tài)變化，采用噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn)測(cè)定肝細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，膠原酶分離的肝細(xì)胞數(shù)量是胰酶的2.4倍，細(xì)胞活力是胰酶的0.3倍，細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，活性和貼壁效果遠(yuǎn)不及胰酶。表明膠原酶分離的大鼠肝細(xì)胞雖然數(shù)量多，但是活力低，而胰酶分離的大鼠肝細(xì)胞數(shù)

2、量雖然不及膠原酶，但是活力高，用于評(píng)價(jià)三種核苷類抗病毒藥物對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用。 以Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培養(yǎng)液調(diào)整肝細(xì)胞密度為3×10<'5>個(gè)／ml，將肝細(xì)胞分為藥物組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。肝細(xì)胞置37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄上清。藥物組分別加入齊多夫定（AZT）濃度為10、5、3.3、2、0.4和0.08mmol／L，阿昔洛韋（ACV）

3、濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.125和0.025mmol／L，更昔洛韋（GCV）濃度為10、4、2、1、0.2和0.04mmol／L。陽性對(duì)照組加入四氯化碳（CCl<,4>）濃度為10、2和0.5mmol／L。陰性對(duì)照組加入含1％二甲基亞砜（DMSO）的DMEM培養(yǎng)液。空白對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液。分別于加樣后6、12和24h檢測(cè)細(xì)胞活性；并于加樣6和12h取培養(yǎng)上清液測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（A

4、LT）、乳酸脫氫酶（LDH）和尿素氮（BUN）的含量，于加樣12h將細(xì)胞進(jìn)行蘇木素一伊紅（HE）染色，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，CCl<,4>濃度高于2mmol／L時(shí)，在各時(shí)間點(diǎn)能顯著降低細(xì)胞活性，顯著增加AST、ALT和LDH的釋放量，顯著降低BUN的合成功能，濃度為10mmol／L時(shí)能引起細(xì)胞變小、核濃縮和核碎裂，濃度為2mmol／L時(shí)能引起細(xì)胞核濃縮。AZT濃度高于3.3和2mmol／L時(shí)，在6、12和24h能

5、顯著降低細(xì)胞活性，在6和12h對(duì)AST、ALT和LDH的釋放量有顯著影響。ACV濃度高于2.5mmol／L時(shí)，在6和12h對(duì)AST和ALT的釋放量有顯著影響。GCV濃度高于4mmol／L時(shí)，在6h對(duì)LDH的釋放量有顯著影響，濃度高于2mmol／L時(shí)，在6和12h對(duì)ALT的釋放量有顯著影響，濃度高于1mmol／L時(shí)，在12h對(duì)AST和LDH的釋放量有顯著影響。AZT、ACV和GCV濃度分別高于3.3、2和1mmol／L時(shí)能引起部分細(xì)胞膜破