埃博霉素異源表達工程菌株的構建及其生物合成產(chǎn)量的研究.pdf

1、埃博霉素(epothilone)是一類來源于纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)具有潛在抗腫瘤活性的16元大環(huán)內(nèi)酯化合物，其作用機理與紫杉醇(paclitaxel)類似，通過穩(wěn)定微管，阻滯微管解聚，使有絲分裂停留在中期，從而誘導腫瘤細胞凋亡。相比于紫杉醇，埃博霉素分子結(jié)構簡單，水溶性更佳，抗腫瘤活性更強。但由于纖維堆囊菌生長緩慢，易受污染，導致埃博霉素目前價格高昂，嚴重限制了其臨床應用，由于缺乏纖維堆囊菌的有效遺傳操作手

2、段，利用其他的原核宿主來實現(xiàn)埃博霉素的異源表達成為了研究的熱點。但埃博霉素的生物合成機制復雜，相關基因簇為56 Kb之大，GC含量在60％以上，傳統(tǒng)的分子生物學技術對埃博霉素基因簇難以進行有效的編輯。本實驗室課題組利用Red/ET同源重組技術構建了埃博霉素基因簇的轉(zhuǎn)座載體，并將其導入到伯克氏菌(Burkholderia)DSM7029的基因組中，篩選得到了一株能合成埃博霉素的基因工程菌株伯克氏菌DSM7029∷Tn5-km-epo，編號

3、為G32。盡管本課題組成功的實現(xiàn)了埃博霉素的異源表達，但其產(chǎn)量不高，總產(chǎn)量僅為3.7μg/L。利用有效的遺傳操作方法提高埃博霉素的異源表達產(chǎn)量成為了當務之急。
　　潛在的埃博霉素轉(zhuǎn)運蛋白基因是位于埃博霉素基因簇外圍的orf3與orf14兩個開放閱讀框編碼的基因，對其氨基酸序列進行同源比對發(fā)現(xiàn)Orf3與Orf14可能是埃博霉素的跨膜運輸載體蛋白，本研究探究了潛在的埃博霉素轉(zhuǎn)運蛋白基因在G32中表達對產(chǎn)物中埃博霉素產(chǎn)量變化的影響，通過

4、Red/ET同源重組技術構建埃博霉素轉(zhuǎn)運蛋白基因表達載體，并將其轉(zhuǎn)入基因工程菌株G32中，獲得一株新的基因工程菌株G32∷orf14-orf3，通過HPLC/MS/MS檢測，實驗發(fā)現(xiàn)新的工程菌株埃博霉素產(chǎn)量比原始提高了1倍左右，結(jié)果表明，潛在轉(zhuǎn)運蛋白基因的異源表達能有效促進伯克氏菌中埃博霉素的生物合成，為實現(xiàn)埃博霉素異源高效表達和探究潛在埃博霉素轉(zhuǎn)運蛋白在埃博霉素次級代謝過程中的調(diào)控作用奠定了重要基礎。
　　源自天藍色鏈霉菌A3(

5、2)的丙酰CoA羧化酶基因（scpccAB基因）能在胞內(nèi)將丙酰CoA羧化合成埃博霉素B、D的重要延伸單元，甲基丙二酰CoA。本文研究了丙酰CoA羧化酶基因G32中表達對產(chǎn)物中埃博霉素產(chǎn)量變化的影響，通過Red/ET同源重組技術構建丙酰CoA羧化酶基因表達載體，并將其轉(zhuǎn)入到基因工程菌株G32中，獲得一株新的基因工程菌株G32∷ scpccAB，通過HPLC/MS/MS檢測，實驗發(fā)現(xiàn)新的工程菌株埃博霉素B、D的產(chǎn)量比原始提高了4倍左右，埃博

6、霉素B、D所占的產(chǎn)物比例由原來的20％提高到了40％。結(jié)果表明，丙酰CoA羧化酶基因的異源表達能有效促進伯克氏菌中甲基側(cè)鏈產(chǎn)物(B、D)的生物合成，增大其代謝通量，為實現(xiàn)埃博霉素異源高效表達和選擇性生物合成研究奠定了基礎
　　除以上兩個基因，本研究還從增強轉(zhuǎn)錄，促進反應后修飾等方面，利用Red/ET同源重組技術構建7kb的epoK基因表達載體，60 kb的自殺型基因打靶載體和70 kb的埃博霉素基因簇與丙酰CoA羧化酶基因轉(zhuǎn)座載體