殺稻瘟菌素的異源表達(dá)及其生物合成機(jī)制的體內(nèi)功能研究.pdf

1、殺稻瘟菌素是一類肽核苷類抗生素。自1958年被發(fā)現(xiàn)以來，它被大規(guī)模用于取代汞制劑農(nóng)藥來防治稻瘟病、白粉病。此外，由于殺稻瘟菌素在真核生物基因工程中可以有效地篩選突變株，它被廣泛的應(yīng)用于生物研究。殺稻瘟菌素的生物合成基因簇于2003年被報(bào)道，但是由于殺稻瘟菌素的天然產(chǎn)生菌的遺傳操作難以進(jìn)行，幾乎沒有關(guān)于殺稻瘟菌素生物合成的體內(nèi)研究的報(bào)道。因此目前報(bào)道的生物合成基因簇的完整性還有待商榷。我們通過構(gòu)建殺稻瘟菌素天然產(chǎn)生菌 S. griseoc

2、hromogenes的基因組文庫，并結(jié)合已發(fā)表的序列，運(yùn)用染色體步移技術(shù)從基因組文庫中釣取出了柯斯質(zhì)粒7D11。測(cè)序結(jié)果表明，7D11包含了殺稻瘟菌素已發(fā)表的DNA序列及其下游的8.6 kb的片段。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這8.6 kb序列中所包含的基因與殺稻瘟菌素生物合成并無關(guān)聯(lián)。
　　為了深入研究殺稻瘟菌素的生物合成機(jī)制，我們通過4次同源重組的方法，將7D11中的插入序列嫁接到了變鉛青鏈霉菌S. lividans HX

3、Y16的染色體上，得到突變株S. lividans LL2。生測(cè)結(jié)果表明，LL2并不能對(duì)殺稻瘟菌素生測(cè)指示菌（紅酵母）產(chǎn)生明顯的抑制作用。進(jìn)一步的發(fā)酵結(jié)果表明，突變株LL2發(fā)酵產(chǎn)物中包含了一種殺稻瘟菌素的衍生物‐去氨基羥化殺稻瘟菌素（deaminohydroxymildiomycin，OH‐BS）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在HXY16中的染色體存在一種可能的殺稻瘟菌素脫氨酶基因SLBSD。體外生化實(shí)驗(yàn)表明，大腸桿菌融合表達(dá)的蛋白SLBSD可

4、以將殺稻瘟菌素轉(zhuǎn)化為OH‐BS。出人意料的是，融合表達(dá)的SLBSD在體外不僅可以以殺稻瘟菌素為底物，它還可以轉(zhuǎn)化另一種核苷類抗生素米多霉素以及殺稻瘟菌素合成的中間產(chǎn)物胞嘧啶葡萄糖醛酸（cytosylglucuronic acid，CGA）。而這兩個(gè)化合物被確認(rèn)是可以在野生型變鉛青鏈霉菌中進(jìn)行異源合成的。緊接著，我們?cè)?HXY16中敲除 SLBSD后得到突變株S. lividans WJ1，其對(duì)于殺稻瘟菌素的抗性從大于200μg/ml下降

5、到了100μg/ml。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)表明：SLBSD是天然存在于變鉛青鏈霉菌染色體上的一個(gè)殺稻瘟菌素抗性基因。
　　在嫁接有殺稻瘟菌素生物合成基因簇的菌株LL2中，我們通過敲除SLBSD得到突變株S. lividans WJ2。發(fā)酵結(jié)果顯示，在WJ2中OH‐BS不再產(chǎn)生，并且WJ2可以正常的異源表達(dá)殺稻瘟菌素。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明了WJ2中包含了完整的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。為了深入的檢測(cè) WJ2中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，以及亞鐵離

6、子對(duì)殺稻瘟菌素生物合成的影響，將WJ2在種子/發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵并用LC‐MS檢測(cè)發(fā)酵液。檢測(cè)結(jié)果表明，WJ2的發(fā)酵液中存在一個(gè)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。通過質(zhì)譜以及二級(jí)質(zhì)譜的分析，證實(shí)這個(gè)代謝產(chǎn)物為去甲基殺稻瘟菌素。
　　為了探究造成去甲基殺稻瘟菌素積累的原因，我們探索了已報(bào)道的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。生物信息學(xué)分析揭示 blsL可能編碼一個(gè)N‐甲基轉(zhuǎn)移酶，因此推斷 blsL可能與去甲基殺稻瘟菌素的形成有關(guān)系?；蛑脫Q的結(jié)果表明，在

7、blsL的被壯觀霉素抗性基因置換的突變株變鉛青鏈霉菌WJ3中不再產(chǎn)生殺稻瘟菌素，并且大量積累去甲基殺稻瘟菌素。同時(shí)，blsL基因回補(bǔ)菌株可以正常產(chǎn)生殺稻瘟菌素，證實(shí)在WJ3中不存在極性效應(yīng)。
　　在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsF的功能未知。通過 BlastP搜索發(fā)現(xiàn)，BlsF與米多霉素生物合成基因簇中MilL有一定同源性。但是milL并不是米多霉素生物合成的必需基因?；蛑脫Q的結(jié)果表明，在blsF被壯觀霉素抗性基因置換后的突

8、變株變鉛青鏈霉菌 WJ4中，殺稻瘟菌素的產(chǎn)量大大提高。不僅如此，在未經(jīng)純化處理的WJ4的發(fā)酵液中還檢測(cè)到了大量殺稻瘟菌素生物合成中間體CGA，進(jìn)一步表明blsF可能是殺稻瘟菌素生物合成中一個(gè)途徑專一行的調(diào)節(jié)基因。
　　在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsE編碼了一個(gè)Radical SAM家族的蛋白，其功能未知。為了開展BlsE的體外生化實(shí)驗(yàn)，需要通過體內(nèi)研究確定BlsE的底物?；蛑脫Q的結(jié)果表明，在用壯觀霉素抗性基因置換了blsE

9、的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ5的發(fā)酵液中，殺稻瘟菌素不再產(chǎn)生，而殺稻瘟菌素生物合成的中間體 CGA得到了大量積累。在米多霉素生物合成途徑的研究中，blsE的同源基因milG的基因置換結(jié)果也得到了類似的結(jié)果。這證實(shí)了BlsE的底物為CGA，為之后BlsE的體外實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　最近的體外生化實(shí)驗(yàn)表明，在殺稻瘟菌素生物合成中經(jīng)歷了一個(gè)脫羧‐再羧化的過程。但是在之前對(duì)基因簇的分析中，并未找到與羧化相關(guān)的基因。深入分析發(fā)現(xiàn)，BlsI可能

10、是一個(gè)潛在的羧化酶。它與生物素羧化酶具有一定的同源性?；蛑脫Q的結(jié)果表明，在壯觀霉素置換了blsI的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ6的發(fā)酵液中，殺稻瘟菌素不再產(chǎn)生，并且還檢測(cè)到了一個(gè)分子量為227的次級(jí)代謝產(chǎn)物。二級(jí)質(zhì)譜分析表明，這個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物包含了一個(gè)胞嘧啶結(jié)構(gòu)，推測(cè)其為殺稻瘟菌素生物合成中的一個(gè)中間產(chǎn)物。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推翻了之前關(guān)于BlsI的功能的推測(cè)。
　　通過在變鉛青鏈霉菌中成功異源表達(dá)殺稻瘟菌素，我們得到了一株殺稻瘟菌素人工產(chǎn)