抗hbsag單鏈抗體與白細(xì)胞介素2融合蛋白的構(gòu)建與序列測定

1、天津醫(yī)藥 2 0D 2 年 8 月第 3 0 卷第 8 期 4萬抗 H B sA g 單鏈 抗體與 白細(xì)胞介 素 一 2 融合蛋 白的構(gòu)建 與序列 測定陳文吟 粟寬源 任 向榮 唐永紅 鄭業(yè)華 余宙耀摘要 目的 : 構(gòu)建以人抗 乙肝表面抗原 (H B s A g )單鏈抗體 (S c Fv ) 為導(dǎo) 向作用, 白細(xì)胞介素 一 2 ( 比 一 2 ) 為治療作用 的融合蛋 白原核表達(dá)載體 pQ E 4 0 / S c F v 一 IL 一

2、 2。 方法: 應(yīng)用 PC R 技術(shù)將抗 H B s掩 單鏈抗體與 白細(xì)胞 介素 一 2 在分子水平上進(jìn)行基 因重組, 構(gòu)建 中間載體 p G E M 7Z f ( + )/ S c F v 一 I L 一 2, 經(jīng)酶切鑒定及序列測定正確后,將 目的基 因片段克隆到 p Q E 4 0 表達(dá)載體中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 經(jīng) I P T G 誘導(dǎo)表達(dá)。 結(jié)果 : S D S 一 P A G E 結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量約 4. 3 x 1 0

3、4 D a 處, 可見蛋 白表達(dá)帶。 以 鼠抗人 I L 一 2 單 克隆抗體經(jīng)免疫印跡驗(yàn)證, 該表達(dá)蛋 白為所設(shè)計(jì) 的融合蛋 白。 結(jié)論: 融合蛋 白 S c Fv 一 I L 一 2 的成功構(gòu)建及表達(dá), 為融合蛋 白的純化和研究開發(fā)新 型 的乙肝導(dǎo)向治療 的基 因工程藥物打下 良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵 詞 抗體, 單克隆 白細(xì)胞介素 一 2 肝炎抗體, 乙型 重組融合蛋 白質(zhì)類白細(xì)胞介素 一 2 ( IL 一 2 ) 又稱 T 細(xì)胞生長 因

4、子,是 T 淋巴細(xì)胞受抗原 或絲 裂原刺激后 分泌 的一 種具有免疫調(diào) 節(jié)作用 的淋 巴 因子。 慢性 乙 型 肝炎是 由乙肝病毒引起 的傳染病, I L 一 2 治療慢性 乙 型肝炎有一定的療效, 但由于其對人體的副作用影 響了療效的發(fā)揮川。 單鏈抗體(S in g l e 一 e ha in Fv ), 是一 種具有抗 原結(jié)合能力的小分子基因工程抗體, 由于其具有相對 分子 質(zhì)量小、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)。 目前, 通 過在其 3’ 斷接上

5、適 當(dāng)?shù)拿浮?細(xì)胞 因子等效應(yīng)分子構(gòu)建雙功能單鏈抗體, 用 于腫瘤及其他疾病的診斷和導(dǎo)向治療有 著廣 泛 的應(yīng) 用前景 【 “, 3 1 。 本研究通 過將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 的抗 H B sA g 單鏈 抗體 (S c Fv ) 與 I L 一 2在分子水平上進(jìn) 行基因重組, 構(gòu)建了 以人抗 H B s瑰為導(dǎo) 向作用, 白細(xì)胞介素 一 2 為治療作用 的融合蛋白 S c F v 一 IL 一 2 表達(dá)載體, 為研究開發(fā)慢性乙型肝炎生 物導(dǎo)

6、向治療藥物 打下 良好 的基礎(chǔ)。1 材料 與方 法1. 1 材料1. 1. 1 質(zhì)粒和菌株: 人抗 H B s傀 單鏈抗體 (S c Fv ) 表 達(dá)質(zhì)粒由本室構(gòu)建 ; 人源性 白細(xì)胞介素一 2 表達(dá)質(zhì)粒由第四軍 醫(yī)大學(xué)生化教研 室提供 ; pG E M 7Z f ( 、一 ) 質(zhì)粒、 JM 10 9 菌株購自 華美生物工程公 司 ; p Q E 4 0 表達(dá)質(zhì)粒、 M 15 !滬E ,’4 』 宿主菌購 自 Q IA G E N 公司

7、。1. 1. 2 工具酶: D N A 限制性 內(nèi)切 酶 B a m H I、 H i n d 111 購 自Pr o m e g a 公司 ; T 4 D N A 連接酶、 P yr o b e s 亡 M D N A 聚合酶購自T A K A R A 公司。1. 1. 3 主要試劑和儀器: PC R 儀 ( B i o m e tr a 公司) ; 小量質(zhì)粒提取試劑盒、 P CR 產(chǎn)物 回收試劑盒購 自上海 華舜 生物工程公 司 ;

8、 鼠抗人 I L 一 2 購 自P B H 公司 ; 羊抗 鼠特異性抗體及堿性磷酸酶顯色試劑均購 自華美生物工程公司 ; P C R 引物委托北京賽百盛生物工程公 司合成。1. 2 方法1. 2. 1 D N A : 質(zhì)粒 D N A 提取、 純化、P C R 產(chǎn)物 回收、 限制性內(nèi)切酶酶切、 感受態(tài)細(xì)胞的制備、 載體 D N A 與 自 身 D N A 片段 的連 接以 及轉(zhuǎn)化感受 態(tài)細(xì)胞 的方 法均參照相關(guān) 試劑 盒說明或文獻(xiàn)[ ’

9、 ]。1. 2. 2 抗 H B sA g 單鏈抗體與 白細(xì)胞介素 一 2 融合蛋白基 因( S c Fv 一 IL 一 2 ) 的獲得 : ( 1 )P C R 引物 的設(shè)計(jì), 本實(shí)驗(yàn)參照重疊延伸剪 接法 ( g e n e s p l ie i n g b y o v e rl a p e r te n s i o n , s o E ) I , j設(shè)計(jì)了擴(kuò)增 S c F v 的上游引物 P l、 下游引物 P Z 和擴(kuò)增 I L

10、-2 的上游引物 P 3、 下游引物 P 4。 在 S c F v 上游引物的 5’端引人 B a m H I 酶切位點(diǎn)和相應(yīng)保護(hù)性堿基 ; 在 I L 一 2 下游引物的 5 ’端引人 H i n d IH 酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)性堿基 ; 在 S c F v下游 引物 和 I L 一 2 上游引物的 5’端分別引人 L i n k e r 的部分堿基序列, 而且兩者在這部分有 2 5 個(gè)堿基是互補(bǔ)的。 另外,在 IL 一 2 下游引物中

11、, 將與 I L 一 2 第 12 5 位氨基 酸 ( C y s )相對應(yīng) 的堿基 A C A 變?yōu)?CG A, 以便通過 PC R 產(chǎn)生定 點(diǎn)突變,從而使 I L 一 2 第 12 5 位氨基酸 由半朧氨酸變?yōu)楸彼帷?上述引物 的堿基序列如下 (小寫斜體部分為酶切位點(diǎn) ; 加下劃線處為堿基突變) :S c F v 上游引物 Pl :5 ’ > T T g g a t c CA G G T G C A G C T ( 引3 T

12、 (; G A(;T C T CCG C C A CT G CCCCC CC〔 :A CCG CT CCC I、C CG C C AC CT CG AIT G A T T T CCA CC T T ( 五 子 T G G A G CG 〔 ;T ( 五 玉 AG G ( 兀G C AG I、G G CG G G G G A G G T A G C G CA CC作者單 位 : 5 1 0 6 0 2 中國人民解放軍廣州空軍 醫(yī)院肝病

13、研究所天津 醫(yī)藥 20 2 年 8 月第 s o 卷第 8 期 4 7 7H B e 勺 轉(zhuǎn)陰 的療 效優(yōu)于小劑量者, 且復(fù)發(fā)率也亦低于后 者。 因此, 提高 IL 一 2 的用藥劑量而降低其毒副作用, 是提高其臨床療效的關(guān)鍵。 將抗 H B sA g 單鏈 抗體與 IL 一 2 融合, 一 方面可 以發(fā)揮抗 H B sA g抗體 中和 H B V 的體液免疫活性, 更重要的是, 可 以利用 抗 H B s掩 單鏈 抗體 結(jié) 合 H B

14、 V 的 特 性, 將IL 一 2 導(dǎo) 向 H B V 感染 的 肝細(xì) 胞表 面, 從 而 提高IL 一 2 復(fù)雜的免 疫調(diào) 節(jié) 作用, 打破 H B V 的免疫耐受狀態(tài), 同時(shí)降低 IL 一 2 的毒副作用, 提高其對慢性 乙 型肝炎患者的治療效果, 為慢性 乙型肝炎 的治療提供一 條新途徑。(圖見封 3 )參考文 獻(xiàn)1 Fl e t ehe r M, G o d st ein A L. R e e e n t ad va n c e

15、 s i n the u n d e r st a n d-i n g o f the b i o e he m i s t r y a n d eli n i e al p h a r m a e o l o g y o f i n te r -l e u ki n - 2. L ym ph o k i n e R e s , 19 8 7, 6 (1 ): 4 5 一 7.2 白玉 杰. 單 鏈抗 體 的研 究與 應(yīng)用. 國外 醫(yī)

16、學(xué)· 免疫 學(xué)分 冊,1 9 9 7 , ( 2 ) : 7 2 一 5.3 武國軍, 赫 曉柯, 金伯泉. 單鏈抗體在腫瘤診 斷治療 中的應(yīng)用研究. 中國腫瘤生物治療 雜志, 19 9 8, 5 ( 2 ) : 14 1 一 3.4 S am b ro k J, F r i s e h E F, M a n i a ti s T. ( 金冬雁, 黎孟楓譯 ). 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 第 2 版. 北京 : 科學(xué) 出版社, 1

17、99 2. 1 一 7 4.5 D i e ff e n b a e h CW, D v e k sl e r G S. PC R 法構(gòu)建 突變基 因及新型重組 基 因, PCR 技 術(shù)實(shí) 驗(yàn)指南. 第 1 版. 北京 : 科 學(xué) 出版社,19 9 8. 4 2 9 一 3 4.6 解 現(xiàn), 姚志建. 白介素 2 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究新進(jìn)展. 國外醫(yī)學(xué)· 分子生物學(xué)分冊, 1 99 0, 1 2(1 ) : 8 一 1 3.7

18、C on d r a jh, s a rd a n n a V V, T o m a s si n i JE, e t a l. B a et e r i a l d e -p r e s s i o n o f a n tib o d y f r ag m e n t s th a t bl o e k hu m a n rh i n o v i r u sin f e e ti o n. J B i o l C h em, 19 9

19、 0, 2 5 6 : 2 2 9 2 一 9.8 B in d o n C, C z e r n i e e ki M, R u ell P, e t a l. Cl e a r a n e e r a t e s a n ds y st em i e eff e et s o f i n t r a ve n o u sl y a d m in i s t e re d IL 一 2 e o n t a i n i咚p r ep a

20、 r a ti o n s i n h u m a n s u b j e et s. B r J C an e e r , 1 98 3, 4 7 (1) : 1 2 3 一3 3.9 K a k um n S, e rh a a r M J, C he st e r K A. Pil o t s t u d y o f r e e o m bi n a n th u m a n i n te rle u k i n 2 f o r

21、e h r o n ie typ e B h e p a ti ti s. H e p at o l o g y ,19 8 8, 8 ( 3 ) : 4 8 7 一 9 2.10 T il y H, E s hha r Z, G r e e n B S, e t a l. Pi l o t s t u d y o f n at u r a l hu m a nin t e r l e u ki n 一 2 i n p a ti e n

22、 t s w i th e hr o n i e H e p ati ti s B. Im-m u n o m o d u l a to r y a n tiv i r al e ff e e t. J H ep a t o l, 19 9 3, 19 : 2 5 9 一 67.1 葉紅軍, 房家智, 高洪文. 白細(xì)胞介 素 2 對慢性乙 型肝炎患者紅細(xì)胞免疫功能的作用. 中國免疫學(xué)雜志, 1 99 1, 7 ( 增刊 ) : 4 3

23、一 7.(2 0 0 1一0 冬2 0 收稿 20 ( ) 么0 1一0 8 修回)T he C o n s tru c ti o n a n d E x Pre s s io n o f A Fu s i o n P ro te j n C o n s i s t i n g o fA n ti一H B s A g S i n g l e C ha i n Fv a n d I n te rl e u k in 一2 E. e o l

24、 iC H E N W e n yin , SU K u a n yu a n , R E N X i a n g r o n g, e t a lR e s e a r e h In s tit u te o f L iv e D is e a se , G u a n 郡h o u A ir F o r c e H O s P 蔥 ta l, C h in a 5 10 60 2O b j e e tiv e : T o eo n

25、s tr u e t a n e x p r e ss i o n v e e to r f o r a n ti一H B sA g S e F v a n d in te r l e u k i n 一2 f u s i o n p r o te in i nE. e o li一2. M e th o d s : U sin g D N A r e e o m b i n a tio n a n d o v e rl a p P C

26、R te e h n o l o g y , a e l o n e d v e e to r P G E M7 Z f( + )/ S e F vf o r a n ti一H B sA g S e F v a n d i n te r l e u k in 一2 f u si o n p r o te in w a s e o n st r u e te d. E n z y m e d i g e st i o n a n d D

27、N A s e q u e n e em e a s u r e m e n t eo n firm e d th a t the S e F v 一IL一2 g e n e h a d b e e n e o r r e e tl y e l o n e d to th e v e e to r , a n d th e n th e ta rg e tg e n e w a s e l o n e d to th e e x p r

28、 e ss i o n v e e to r PQE 4O, e ho sin g th e p a ss i v e e l o n e to t r a n s f o r m i n to E. eo l i a n d in d u e e db y IPT G to e x p r e s sio n Pr o te i n. R e s u l ts : A r e e o m bin a n t e x p r e s s

29、io n pl a sm i d PQ E 40 / S e F v 一IL一2 w a s eo n st r u e t -e d. 4. 3 k U e x p r es s i o n Pr o te in w a s o bs e rv e d by S D S一P A G E, a n d W e st e r n b l o t w ith m o u se a n ti一h u m a n IL一2 M e A bs h

30、 o w e d th a t th e e x p r e ss e d p r o d u e ts w e r e d e s ig n e d f u s i o n p r o te i n. C o n e l u s i o n : T h e s u e ee s s i n eo n s tr u e ti o n a n de x p r e ss i o n o f fu s i o n p r o te in m

31、 a k e s it p o ss ibl e to e a r r y o u t f u r th e r s tu die s o n its p u r if i e a tio n a n d th e t a rg e te dt he r a p y o f g e n e 一e n g i n e e r i n g p h a rm a e e u ti e to H B v ir u s.K e y w o rd

32、s a n tibo d i e s , m o n o e l o n a l in te rl e u kin 一2 he p a ti t i s B a n ti b o d ie s r e eo m b i n a n t fu s i o n p r o te i n s致 作 者您在本刊發(fā)表過的文章, 凡榮獲 以下榮譽(yù), 煩請將有關(guān)證 書、 獎狀的復(fù)印件及有關(guān)說 明,發(fā)表, 一并反饋給我編輯部。 我編輯部將定期集 中張榜