《酶工程》課件-微生物發(fā)酵產酶

1、1,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,到目前為止，已知的酶有幾千種，按照其化學組成，可以分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）。 酶的生物合成主要是指細胞內RNA和蛋白質的合成過程。所以本節(jié)簡要地闡述RNA和蛋白質生物合成及其調節(jié)控制的基本理論，即：,酶生物合成,是指酶在生物體內合成的過程。,,1、中心法則- Central Dogma,2、RNA的生物合成-Transcription,3、蛋白質的生物合成- Translati

2、on,4、酶生物合成的調節(jié)- Regulation,2,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（一）中心法則,1958年，克里克提出中心法則，認為在通常的細胞中，遺傳信息的傳遞方向是：,轉錄 翻譯 DNA RNA 蛋白質,某種細胞能否合成某種酶分子，首先取決于細胞中的遺傳信息載體——DNA分子中是否存在有該酶所對應的基因。,根據中心法則，DNA分子可以通過復制生成

3、新的DNA，再通過轉錄生成對應的RNA，然后再翻譯成為多肽鏈，經加工而成為具有完整空間結構的酶分子。,,,3,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（一）中心法則,Replication 復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription 轉錄：是指以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在依賴DNA的RNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNA的過程。 Translati

4、on 翻譯：亦叫轉譯，是指以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。 Reverse translation 逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。,4,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（二）RNA的生物合成——轉錄,1、轉錄過程,轉錄過程分為4個階段,（1）轉錄的起始,（2）RNA鏈的延伸,（3）RNA鏈合成的終止,（4）RNA前體的加工,,

5、5,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（二）RNA的生物合成——轉錄,3、RNA的生物功能,(1) 在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。,(2) 在蛋白質的生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作

6、為蛋白質生物合成的場所。,(3) 某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關的生化反應。,(4) 各種小分子RNA在分子修飾和代謝調節(jié)等方面有重要作用。,,6,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（三）蛋白質的生物合成——翻譯,1、翻譯過程,翻譯實際上是將mRNA分子上的堿基排列次序轉變?yōu)槎嚯逆溕习被岬呐帕写涡虻倪^程，分為5個階段：,（1）氨基酸活化生成氨?！猼RNA,（2）肽鏈合成的起始,（3）肽鏈合

7、成的的延伸,（4）肽鏈合成的終止,,（5）蛋白質前體的加工,7,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),1、細胞合成的酶的分類,每一個細胞都可以在一定的條件下合成多種多樣的酶。細胞合成的酶的分類：,（1）組成型酶：即在細胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對此類酶的合成速率影響不大。,（2）適應型酶：即在細胞中的量變化較大，環(huán)境因素對此類酶的合成速率影響較大。,,,,8,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶

8、生物合成的調節(jié),酶生物合成要經過一系列的步驟，需要許多因素的參與。因此，在轉錄和翻譯過程中，許多因素都會影響適應型酶生物合成。研究結果表明，至少在原核生物中，甚至在所有生物中，轉錄水平的調節(jié)（又稱為基因的調節(jié)）是酶生物合成中最重要的調節(jié)。 下面介紹原核生物中酶生物合成的調節(jié)。,2、基因的調節(jié)是酶生物合成中最重要的調節(jié),,9,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,①結構基因,

9、特點與作用,（1）參與酶合成的DNA分子上基因的分類,與酶有各自的對應關系，結構基因中遺傳信息可以轉錄成mRNA上的遺傳密碼，再經翻譯成蛋白質的多肽鏈。,②操縱基因,特點與作用,可以特異性地與調節(jié)基因產生的阻遏蛋白（一種變構蛋白）中的一種結合，從而操縱酶合成的時機及速度 。,,10,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,③啟動基因,特點與作用,（1）參與酶合成的DNA分子上基因的分類,,啟

10、動基因由兩個位點組成,RNA聚合酶的結合位點,cAMP—CAP復合物的結合位點（當cAMP的濃度低時，影響結合）,只有在cAMP—CAP復合物結合到啟動基因的位點上時，RNA聚合酶才能結合到其在啟動基因的位點上，這樣，酶的合成才有可能開始。啟動基因決定酶的合成能否開始。,,11,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,④調節(jié)基因,特點與作用,（1）參與酶合成的DNA分子上基因的分類,可以產生

11、一種阻遏蛋白（變構蛋白），其分子表面至少有兩個配基結合部位，一個與操縱基因結合，一個與效應物[誘導物或輔（共）阻遏物]結合。這種阻遏蛋白的專一性很強，只能與特定操縱子的操縱基因結合。,,12,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,①概念：是細胞基因表達系統(tǒng)的一種功能單位。由啟動基因、操縱基因和幾個功能相關的結構基因組成。,（2）操縱子,,②分類：根據操縱子中阻遏蛋白的性質不同， 操縱子分為

12、誘導型和阻遏型兩種基本類型。,13,微生物發(fā)酵產酶,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,③操縱子的作用機理,（2）操縱子,,A、誘導型操縱子,調節(jié)基因產生的阻遏蛋白合成之后就呈活性狀態(tài)，可與操縱基因結合。(由于空間排擠作用，RNA聚合酶無法結合到啟動基因的位點上，也就無法進入結構基因位置，遺傳信息不能表達。)誘導物能使阻遏蛋白變構脫落，結構基因得以表達。,,14,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合

13、成的調節(jié),3、基因的調節(jié)理論,③操縱子的作用機理,（2）操縱子,,B、阻遏型操縱子,調節(jié)基因產生的阻遏蛋白合成之后呈無活性狀態(tài)，不能與操縱基因結合。(此時如果RNA聚合酶已結合在啟動基因位點上，就能夠通過操縱基因進入結構基因位置，遺傳信息得以表達。)輔阻遏物使其變構活化，操縱子被阻，結果遺傳信息不能表達。,,微生物發(fā)酵產酶,15,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,總結：轉錄水平的調

14、節(jié)模式有三種，即分解代謝物阻遏作用、酶生物合成的誘導作用和酶生物合成的反饋阻遏作用。 啟動基因上cAMP-CAP復合物的結合與否，對酶的生物合成起調節(jié)作用。 對于誘導型操縱子，在無誘導物的情況下，其基因表達水平很低或不表達，只有在有誘導物存在的條件下，才能轉錄生成mRNA，進而合成酶。 對于阻遏型操縱子，在無阻遏物的情況下，基因表達正常，當有阻遏物存在時，轉錄受阻。,研究表明，誘導型操縱子同時具有分解代謝物

15、阻遏作用和酶生物合成的誘導作用；阻遏型操縱子同時具有操縱基因的調節(jié)和衰減子的調節(jié)兩種反饋阻遏作用。,16,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,主要內容：,（1）概念 （2）作用機理 （3）實質 （4）應用,17,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（1）分解代謝物阻遏作用,指某些物質（主要是指葡萄

16、糖和其它容易利用的碳源等）分解代謝的產物阻遏某些酶（主要是誘導酶）生物合成的現(xiàn)象。,,① 概 念,,18,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（1）分解代謝物阻遏作用,A、cAMP濃度降低,②作用機理,a、當容易利用的碳源過量存在時，通過代謝途徑進行降解，放出的能量有一部分存儲在ATP中，細胞中ATP濃度增加。,b、ATP是由ADP和AMP通過磷酸化作用生成的，ATP濃度增加，

17、AMP濃度降低。,,19,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（1）分解代謝物阻遏作用,B、轉錄受阻,②作用機理,由于cAMP濃度降低，就使cAMP—CAP復合物的濃度降低，啟動基因上沒有cAMP—CAP復合物結合，RNA聚合酶不能結合到啟動基因的位點上，使結構基因上的遺傳信息無法轉錄。,,20,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶

18、,（1）分解代謝物阻遏作用,③分解代謝物阻遏作用的解除,隨著細胞生長和新陳代謝的進行，細胞中ATP濃度的下降，而使ADP、AMP、cAMP的濃度增加。當cAMP的濃度增加到一定量的時候，cAMP—CAP復合物結合到啟動基因的特定位點上，RNA聚合酶也隨著結合到相應的位點上，酶的生物合成就有可能進行。,,21,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（1）分解代謝物阻遏作用,④分解代謝物阻

19、遏作用及該阻遏作用解除的實質,實質是cAMP通過啟動基因對酶生物合成的調節(jié)控制。,,22,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（1）分解代謝物阻遏作用,⑤ 應 用,在酶的發(fā)酵生產中，在培養(yǎng)基中碳源的選擇上要注意以下幾點 ：,A、不使用有分解代謝阻遏作用的碳源，采用其它較難利用的碳源。,B、采用補料、分次流加碳源等方法控制容易利用的碳源的濃度。,C、當容易利用的碳源過量存在時，

20、加入一定量的cAMP可解除分解代謝物阻遏作用。,,,23,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,A、酶生物合成的誘導作用,加進某些物質，使酶的生物合成開始或加速進行的過程，稱為酶生物合成的誘導作用。,,,24,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,B、誘導

21、物（誘導劑）,指對酶的生物合成起誘導作用的物質。一般是酶催化作用的底物或其底物類似物。,,,25,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,B、誘導物（誘導劑）,誘導物一般分為四類：,許多誘導酶都可由其作用底物誘導產生。,例如：大腸桿菌生長在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中，每個細胞平均只含有1分子β—半乳糖苷酶。若將該細胞轉移到含有乳糖而不含葡萄糖的培

22、養(yǎng)基中，2min后開始大量產生β—半乳糖苷酶，平均每個細胞產生3000分子β—半乳糖苷酶。,a、酶的作用底物,,,26,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,B、誘導物（誘導劑）,誘導物一般分為四類：,不能被酶作用或很少被酶作用的底物類似物，是酶生物合物的最有效的誘導物。,例如：異丙基—β—D—硫代半乳糖苷(IPTG)對β—半乳糖苷酶的誘導效果比

23、乳糖高幾百倍；蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶的誘導效果比蔗糖高幾十倍等。,b、酶的底物類似（是最有效的誘導物）,,,27,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,B、誘導物（誘導劑）,誘導物一般分為四類：,有些酶可由其催化反應的產物誘導產生。,例如：半乳糖醛酸是果膠酶催化果膠水解的產物，它卻可以作為誘導物，誘導果膠酶的產生。,c、酶的反應產物,,,28

24、,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,①基本概念,B、誘導物（誘導劑）,誘導物一般分為四類：,有些酶的反應產物類似物也可誘導酶的產生。,d、酶的反應產物類似物,,29,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,②作用機理,A、在無誘導物存在時，調節(jié)基因(R)產生的阻抑蛋白與操縱基因

25、(O)的結合力較強，當它們結合時，就使已經在啟動基因(P)上的RNA聚合酶無法經過操縱基因位置而進入結構基因(S)的位置。因此遺傳信息無法轉錄，酶不能合成(圖2—4A)。,,30,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,②作用機理,B、當有誘導物存在時，誘導物與阻抑蛋白結合在一起，使阻抑蛋白的結構發(fā)生改變，使之與操縱基因的結合力減弱。阻抑蛋白不能與操縱基因結合

26、，就使RN A聚合酶可以順利通過操縱基因位置而到達結構基因位置。進行轉錄生成mRNA，再近一步翻譯成酶蛋白多肽鏈(圖2—4B)。,,31,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用,③ 實 質,實質是誘導物與阻抑蛋白結合在一起，使阻抑蛋白的結構發(fā)生改變。,,32,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生

27、物合成的誘導作用,④ 應 用,在酶的發(fā)酵生產中：,A、在培養(yǎng)基中碳源的選擇上，應盡量選用對所需的酶有誘導作用的碳源。,例如，α—淀粉酶的發(fā)酵生產中，應選用對該酶有誘導作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶的生物合成有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源；β—半乳糖苷酶發(fā)酵應選用乳糖為碳源，而不用或少用葡萄糖為碳源等。,,33,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（2）酶生物合成的誘導作用

28、,④ 應 用,在酶的發(fā)酵生產中：,B、不同的酶有不同的誘導物，同一種酶有多種誘導物，實際應用時應根據酶的特性、誘導效果和誘導物來源等進行選擇。,,34,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（3）酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）,①基本概念,反饋阻遏作用,指酶催化作用的產物或代謝途徑的末端產物使該酶的生物合成受阻的過程。,,,35,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合

29、成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（3）酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）,①基本概念,共阻遏物（輔阻遏物）,指對酶的生物合成起反饋阻遏作用的物質。一般是酶催化作用的產物或代謝途徑的末端產物。,,例如，無機磷酸是堿性磷酸酶催化磷酸單酯水解的產物，而它的過量存在，卻可阻遏堿性磷酸酶的生物合成；組氨酸作為組氨酸合成途徑的終產物，它的過量積累卻反過來對其合成途徑中的10種酶的生物合成均起反饋阻遏作用。,,36,一、酶生物

30、合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（3）酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）,②作用機理,A、在沒有共阻遏物存在時，調節(jié)基因(R)產生的阻抑蛋白與操縱基因(O)的親和力弱，不能與操縱基因結合，所以已結合在啟動基因(P)上的RNA聚合酶能順利通過操縱基因位置到達結構基因(S)位置，進行轉錄，進而合成酶蛋白多肽鏈(圖2—5A)。,,37,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、

31、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（3）酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）,③實質,實質是阻抑蛋白與共阻遏物特異結合，使阻抑蛋白結構發(fā)生改變。,,38,一、酶生物合成的基本理論,（四）酶生物合成的調節(jié),4、轉錄水平的調節(jié)模式,微生物發(fā)酵產酶,（3）酶生物合成的反饋阻遏作用（產物阻遏作用）,④應用,在酶的發(fā)酵生產中，控制阻遏物濃度能解除阻遏，提高酶產量。,例如，枯草桿菌堿性磷酸酶受其反應產物無機磷酸的阻遏，當培養(yǎng)基中無機磷含量在1

32、．0umol／mL以上時，該酶的合成完全受阻遏。當培養(yǎng)基中無機磷含量在0．01umol／mL以下時，該酶大量產生。所以，為了提高堿性磷酸酶的產量，必須限制培養(yǎng)基中無機磷的含量。,,,39,一、酶生物合成的基本理論,微生物發(fā)酵產酶,酶生物合成的基本理論學習要點：,1、轉錄、翻譯的概念及主要過程2、基因調節(jié)控制理論3、基因對酶生物合成調節(jié)控制的三種模式的概念、作用機理、實質及應用。,（四）酶生物合成的調節(jié),40,一、酶生物合成的基本理論

33、,微生物發(fā)酵產酶,（五）真核生物中酶生物合成的調節(jié)機制,真核生物比原核生物的結構復雜得多，其基因的表達和調節(jié)控制也復雜得多。到目前為止，還沒有統(tǒng)一的理論和模型來闡述真核生物中酶生物合成的調節(jié)規(guī)律。,41,微生物發(fā)酵產酶,二、常用的產酶微生物,2、常用的產酶微生物舉例,1、用于酶生產的細胞必須具備的條件,本節(jié)主要內容：,42,微生物發(fā)酵產酶,二、常用的產酶微生物,（一）用于發(fā)酵產酶的細胞必須具備的條件,（5）安全可靠、無毒性。,（4）利于

34、酶產品的分離純化。,（3）產酶穩(wěn)定性好。,（2）容易培養(yǎng)和管理。,（1）酶的產量高。,,43,微生物發(fā)酵產酶,二、常用的產酶微生物,（2）應用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農業(yè)上用作生產糖化飼料的菌種。,（1）特點：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質，有的可產生致癌性的黃曲霉毒素。,3、曲霉(Aspergillus),（二）舉

35、例,44,微生物發(fā)酵產酶,二、常用的產酶微生物,（2）應用：根霉能產生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產生乳酸、延胡索酸等有機酸。,（1）形態(tài)、特點：因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。,5、根

36、霉(Rhizopus),（二）舉例,45,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,酶的發(fā)酵生產是以獲得大量所需的酶為目的。因此，除了選擇性能優(yōu)良的產酶細胞以外，還必須滿足細胞生長、繁殖和發(fā)酵產酶的各種工藝條件，并要根據發(fā)酵過程的變化進行優(yōu)化控制。 此外，還可以采取某些行之有效的措施。,本節(jié)主要內容：,（一）酶發(fā)酵生產的一般工藝流程,（二）細胞活化和擴大培養(yǎng),（三）培養(yǎng)基的配制,（四）pH值的調節(jié)控制,（五）溫度的調節(jié)控制,（六）溶解氧的

37、調節(jié)控制,（七）提高酶產量的措施,46,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（一）酶發(fā)酵生產的一般工藝流程,酶發(fā)酵生產的一般工藝流程如下圖,,47,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（二）細胞活化和擴大培養(yǎng),細胞活化,性能優(yōu)良的產酶細胞選育出來以后，必須盡可能保持其生長和產酶特性不變異，不死亡，不被雜菌污染等。就必須采取妥善的保藏方法，以備隨時應用。,細胞活化是指保藏的菌種在用于發(fā)酵之前，必須接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上，在一定的

38、條件下進行培養(yǎng)，以恢復細胞的生命活動能力的過程。,,,48,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（二）細胞活化和擴大培養(yǎng),擴大培養(yǎng),為了保證發(fā)酵時有足夠數(shù)量的優(yōu)質細胞，活化了的細胞一般要經過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)。,用于細胞擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。,49,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（二）細胞活化和擴大培養(yǎng),種子培養(yǎng)基的要求,1、含氮源豐富。,2、碳源含量相對較少。,3、種子培養(yǎng)條件應滿足細胞生長要求。,4、培養(yǎng)時

39、間不宜太長，一般培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即可接入下一級擴大培養(yǎng)或接入發(fā)酵。,5、控制好種子量與培養(yǎng)量的比例。接入發(fā)酵的種子的量一般為發(fā)酵培養(yǎng)基總量的1～10％。,,50,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,1、培養(yǎng)基,指人工配制的用于細胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質的混合物。,,2、培養(yǎng)基的設計和配制原則,（1）營養(yǎng)成分的種類及比例要恰當。,（2）控制適當pH值。,（3）經濟節(jié)約。,,3、培養(yǎng)基的組成,一般包括碳源、氮源、

40、無機鹽、生長因素和水。,51,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（1）碳 源,概 念,指能夠向細胞提供碳素化合物的營養(yǎng)物質。,,選擇碳源的要求,①滿足細胞生長、發(fā)酵的營養(yǎng)要求。,②注意碳源對酶生物合成的調節(jié)作用。,③考慮原料的價格及供求狀況。,,,來源,糖類、醇類、脂類、有機酸、烴類、蛋白質及其降解物等。,,52,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成

41、,（2）氮 源,概 念,指能夠向細胞提供氮元素的營養(yǎng)物質。,,①有機氮源：各種蛋白質及其水解產物。如酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽和氨基酸等。,②無機氨源：含氮的各種無機化合物。如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀和硝酸鈉等。,,,氮源可分為有機氮源和無機氮源兩種：,氮源的分類,,53,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（2）氮 源,選擇氮源的要求,①滿足不同細

42、胞的要求,一般說來，動物細胞要求有機氨，植物細胞主要要求無機氮，微生物細胞中，異養(yǎng)型微生物用有機氮，自養(yǎng)型微生物用無機氮。,②碳和氮的比例要恰當,所謂碳氮比(C／N)—般是指培養(yǎng)基中碳元素(C)的總量與氮元素(N)總量之比。有時也采用培養(yǎng)基中碳源總量和氮源總量之比來表示碳氮比。使用時要注意兩種比值是不同的。,,,,,54,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（3）無機鹽,作用,來源,①提供細胞生

43、命活動不可缺少的無機元素。,添加無機鹽。 如硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。,②對培養(yǎng)基的pH值，氧化還原電位和滲透壓起調節(jié)作用。,,,,55,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（4）生長因素（生長因子）,概念,來源,①一般在培養(yǎng)基中添加含有多種生長因素的天然原料的水解物，如玉米漿、酵母膏、麩皮水解液等。,指細胞生長繁殖必不可少的微量有機化合物，主要包括各種氨基

44、酸、嘌呤、嘧啶、維生素以及動植物生長激素等。,②在培養(yǎng)基中加入某種或某幾種提純的有機化合物。,,,,56,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（5）水,作用,①微生物最基本的組成成分。,②微生物體內和體外的溶劑。,,,③細胞質組分，直接參與各種代謝活動。,④調節(jié)細胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定。,57,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（5）常用的幾種酶發(fā)

45、酵培養(yǎng)基,實驗室的常用培養(yǎng)基：細菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）。放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基。酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基。霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基。,58,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（三）培養(yǎng)基的配制,3、培養(yǎng)基的組成,（5）常用的幾種酶發(fā)酵培養(yǎng)基,①黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10％，豆餅粉4％，麩皮4%(pH4.4～5.0)。,②游動放線菌葡萄糖異構酶發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2％，豆餅粉2％，磷酸氫二鈉0

46、．1％，硫酸鎂0．05％(PH7．2)。,③桔青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖5％，蛋白胨0．5％，硫酸鎂0．05％，氯化鈣0．04％，磷酸氫二鈉0．05％，磷酸二氫鉀0．05％。,,59,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（四）pH值的調節(jié)控制,1、原 因,培養(yǎng)基的pH值與細胞的生長、繁殖和發(fā)酵產酶有密切關系。,（1）不同細胞生長繁殖的最適pH值有所不同。,例如；一般細菌和放線菌的生長最適pH值為中性或微堿性(pH 6

47、．5～8．0)；霉菌和酵母的生長最適pH值為偏酸性(pH 4．0～6．0)；植物細胞生長的生長最適pH值為 pH5～6。,（2）細胞發(fā)酵產酶的最適pH值通常接近于該酶反應的最適pH值。,例如：發(fā)酵生產堿性蛋白酶的最適pH值為堿性(pH8．5～9．0)；生產中性蛋白酶的pH為中性至微酸性(pH6．0～7．0)為宜；而酸性(pH 4～6)條件有利于酸性蛋白酶的產生。,,60,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（四）pH值的調節(jié)控制,1

48、、原 因,（3）有些細菌在該酶反應的最適pH條件下，細胞受到影響，故有些細胞的產酶最適pH值與酶作用的最適pH有明顯差別。,例如：枯草桿菌堿性磷酸酶作用最適pH為9．5，而產酶最適pH值為7．4。,（4）有些細胞可以同時產生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產量比例。,例如：用米曲霉生產蛋白酶，當培養(yǎng)基的pH值為堿性時，主要生產堿性蛋白酶，降低培養(yǎng)基的pH值，則主要生產中性或酸性蛋白酶。,,61,三、發(fā)酵工藝

49、條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（四）pH值的調節(jié)控制,1、原 因,（5）培養(yǎng)基的pH值在細胞生長繁殖和代謝物產生的過程中往往會發(fā)生變化。這種變化與細胞特性有關，也與培養(yǎng)基的組分密切相關。,①含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產生有機酸，會使培養(yǎng)基的pH使向酸性方向移動。,②含蛋白質、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經代謝產生較多的胺類物質，使pH值向堿性方向移動。,③以硫酸銨為氮源時，隨著銨離子被細胞利用，使培養(yǎng)基pH值下降。,,④以尿素為氮源時，先

50、隨著尿素被脲酶水解生成氨，使培養(yǎng)基pH上升，然而又隨著氨被細胞同化而使pH值下降。,⑤磷酸鹽的存在，對培養(yǎng)基的pH值起一定的緩沖作用。,例 如,62,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（四）pH值的調節(jié)控制,2、方 法,（1）調整培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的種類或比例。,（2）加入緩沖溶液穩(wěn)定pH值。,（3）添加適宜的酸、堿溶液。,,63,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（五）溫度的調節(jié)控制,1、原 因,溫度是影響細胞生長

51、、繁殖和發(fā)酵產酶的重要因素之一。,（1）細胞發(fā)酵產酶的最適溫度往往低于最適生長溫度。,由于在較低的溫度條件下，可提高酶的穩(wěn)定性，延長細胞產酶時間。但并不是溫度越低越好，若溫度過低，生化反應速度很慢，反而降低酶產量，延長發(fā)酵周期。故必須進行試驗，以確定最佳產酶溫度。,例如，用醬油曲霉生產蛋白酶，在28℃條件下發(fā)酵，其蛋白酶的產量比在40℃條件下高2～4倍。,（2）不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。,例如：枯草桿菌的最適生長溫度為34～3

52、7℃，黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃，植物細胞的最適生長溫度為25℃左右。,,,64,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（五）溫度的調節(jié)控制,2、方 法,一般采用熱水升溫，冷水降溫。,,65,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,1、原 因,只有在溶解氧存在時，培養(yǎng)基中的供能物質才能進行有氧降解而產生大量的ATP等高能物質，以滿足細胞生長繁殖和發(fā)酵產酶所需要的大量能量。,,66,三、發(fā)酵工藝

53、條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,2、原 理,（1）相關概念,①耗氧速率KO2,是指單位體積的培養(yǎng)液中的細胞在單位時間內所消耗的氧氣量。KO2=QO2.Cc,QO2：細胞呼吸強度，是指單位細胞量在單位時間內的耗氧量。,,,Cc：細胞濃度，是指單位體積培養(yǎng)液中細胞的量。,在酶的發(fā)酵生產中，不同生長階段的細胞，QO2和Cc各不相同，所以KO2也不相同，必須根據耗氧量的不同給適量的溶解氧。,67,三、發(fā)酵工藝條件及控制

54、,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,2、原 理,（1）相關概念,,,②溶氧速率（又稱氧的溶解速度，溶氧系數(shù)）Kd,是指單位體積的發(fā)酵液在一定時間內所有能溶解的氧的量。,Kd與通氣量、氧的分壓、氣液接觸時間及面積、培養(yǎng)液的性質有關。,68,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,2、原 理,,根據細胞對溶解氧的需要量，進行連續(xù)不斷地供氧，使培養(yǎng)基中的溶解氧量維持在一定的濃度范圍內。,（2）原 理

55、,,69,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法,（1）調節(jié)通氣量,,（2）調節(jié)氧的分壓,（3）調節(jié)氣液接觸時間,（4）調節(jié)氣液接觸面積,（5）改變培養(yǎng)液的特性,70,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法,隨著發(fā)酵過程的進行，細胞耗氧速率不斷改變，必須相應地對溶氧速率進行調節(jié)。,（1）調節(jié)通氣量,通氣量是指單位時間內流經培養(yǎng)液的空氣量(L／min)

56、。,當通氣量增大時，可提高溶氧速率，反之，減少通氣量，則使溶氧速率降低。,,71,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法,隨著發(fā)酵過程的進行，細胞耗氧速率不斷改變，必須相應地對溶氧速率進行,（2）調節(jié)氧的分壓,增加空氣壓力，或提高空氣中氧的含量，都能提高氧的分壓，從而提高溶氧速率。反之剛使溶氧速率降低。,,72,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法

57、,隨著發(fā)酵過程的進行，細胞耗氧速率不斷改變，必須相應地對溶氧速率進行。,（3）調節(jié)氣液接觸時間,氣液兩相接觸時間延長，可使更多的氧溶解，從而提高溶氧速率；反之則使溶氧速率降低。 可以通過增加液層高度，在反應器中增設擋板等方法以延長氣液接觸時間。,,73,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法,隨著發(fā)酵過程的進行，細胞耗氧速率不斷改變，必須相應地對溶氧速率進行。,（4）調節(jié)氣液

58、接觸面積,氧氣溶解到培養(yǎng)液是通過氣液兩相的界面進行的。增加氣流接觸界而的面積，有利于提高溶氣速率。為了增大氣液接觸面積，應使通過培養(yǎng)液的空氣盡量分散。,,在發(fā)酵容器的底部安裝空氣分配管，使分散的氣泡進入液層，是增加氣液接觸面積的主要方法。裝設攪拌裝置或增設擋板等可使氣泡進一步打碎和分散，也能有效地增加氣液兩相的接觸面積，從而提高溶氧速率。,74,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,3、方 法,隨著發(fā)酵

59、過程的進行，細胞耗氧速率不斷改變，必須相應地對溶氧速率進行。,（5）改變培養(yǎng)液的特性,培養(yǎng)液的特性對溶氧速率有明顯影響，若培養(yǎng)液的粘度大，產生泡沫多，則不利于氧的溶解。通過改變培養(yǎng)液的組分或濃度，可有效地降低培養(yǎng)液粘度，加入適宜的消泡劑或設置消泡裝置，以消除泡沫的影響，都可提高溶氧速率。,,75,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（六）溶解氧的調節(jié)控制,4、調節(jié)控制溶解氧應注意的問題：,應使溶氧速率等于或稍高于耗氧速率。,①如果溶

60、氧速率低于耗氧速率，則細胞得不到所需的供氧量，必然影響其生長和產酶。,②溶氧速率過高，對發(fā)酵也不利，表現(xiàn)在：,A、造成浪費。,B、抑制某些酶的生成。,C、要獲得高溶氧速率而采用的相關措施會使某些細胞等受到損傷。,,76,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（七）提高酶產量的措施,在酶的發(fā)酵生產過程中，為了提高酶產量，除了選育優(yōu)良的產酶細胞，保證發(fā)酵工藝條件并根據需要和變化情況及時加以調節(jié)控制以外，還可以采取某些行之有效的措施。主要有

61、：,1、添加誘導物。,2、控制阻遏物濃度。,3、添加表面活性劑。,,4、添加產酶促進劑 。,77,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（七）提高酶產量的措施,在酶的發(fā)酵生產過程中，為了提高酶產量，除了選育優(yōu)良的產酶細胞，保證發(fā)酵工藝條件并根據需要和變化情況及時加以調節(jié)控制以外，還可以采取某些行之有效的措施。主要有：,1、添加誘導物。,2、控制阻遏物濃度。,3、添加表面活性劑,①表面活性劑可分為離子型和非離子型兩大類。由于離子型表面活

62、性劑有些對細胞有毒害作用，特別是季胺型離子表面活性劑(如“新潔而滅”等)是消毒劑。不能用于酶的發(fā)酵生產。,（1）使用表面活性劑時應注意的問題：,②非離子型表面活性劑，如吐溫(Tween)、特里頓(Triton)等，在使用時，要注意表面活性劑添加量，過多或過少部效果不好，應控制在最佳濃度范圍內。,,,78,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（七）提高酶產量的措施,在酶的發(fā)酵生產過程中，為了提高酶產量，除了選育優(yōu)良的產酶細胞，保證發(fā)酵

63、工藝條件并根據需要和變化情況及時加以調節(jié)控制以外，還可以采取某些行之有效的措施。主要有：,1、添加誘導物。,2、控制阻遏物濃度。,3、添加表面活性劑,（2）作用,（1）使用表面活性劑時應注意的問題：,②有利于提高酶的穩(wěn)定性和催化能力。,,,①增加細胞的通透性，有利于酶的分泌而提高酶產量。,79,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,（七）提高酶產量的措施,在酶的發(fā)酵生產過程中，為了提高酶產量，除了選育優(yōu)良的產酶細胞，保證發(fā)酵工藝條件并

64、根據需要和變化情況及時加以調節(jié)控制以外，還可以采取某些行之有效的措施。主要有：,1、添加誘導物。,2、控制阻遏物濃度。,3、添加表面活性劑。,,4、添加產酶促進劑 。,產酶促進劑是指可以促進產酶、但作用機理并未闡明清楚的物質。,添加產酶促進劑往往對提高酶產量有顯著效果。,例如，添加植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶和桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍。添加聚乙烯醇可提高糖化酶的產量。,80,三、發(fā)酵工藝條件及控制,微生物發(fā)酵產酶,小

65、 結,在酶的發(fā)酵生產中，提高酶產量的主要方法有 ：,1、選育優(yōu)良的產酶細胞。,2、保證細胞生長、繁殖和發(fā)酵工藝條件并根據需要和變化情況及時加以調節(jié)控制。,3、采取某些行之有效的措施：,（1）添加誘導物。,（2）控制阻遏物濃度。,（3）添加表面活性劑。,（4）添加產酶促進劑。,,,81,四、酶發(fā)酵動力學,微生物發(fā)酵產酶,選育性能優(yōu)良的產酶細胞（具備的條件是什么？）,保藏細胞（為什么？）,細胞活化（為什么？）,細胞擴大培養(yǎng)（為什么？）,發(fā)酵

66、產酶,基質,分離純化,,細胞生長,細胞產酶,過程是轉錄和翻譯,過程受很多因素的影響-調節(jié)控制的理論及模式,,細胞生長速度及影響因素,產物生成速度及影響因素,基質消耗速度及影響因素,,,,,,,,,,酶發(fā)酵動力學的研究內容,,,酶產品,微生物發(fā)酵產酶第一～三節(jié)總結：,82,四、酶發(fā)酵動力學,微生物發(fā)酵產酶,本節(jié)主要內容：,（一）研究酶發(fā)酵動力學的意義,（二）酶生物合成的模式,（三）細胞生長動力學,（四）細胞產酶動力學,83,四、酶發(fā)酵動力

67、學,微生物發(fā)酵產酶,(一)研究酶發(fā)酵動力學的意義,1、酶發(fā)酵動力學的研究內容,主要研究發(fā)酵過程中細胞生長速度、產物生成速度、基質消耗速度以及環(huán)境因素對這些速度的影響。,,2、研究酶發(fā)酵動力學的意義,（1）有助于了解酶生物合成及其調節(jié)理論和調節(jié)控制的模式。,（2）有助于了解酶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制。,（3）有助于了解酶生物合成的模式。,（4）有助于了解細胞中酶生物合成的一般模型。,,84,四、酶發(fā)酵動力學,微生物發(fā)酵產酶,(二)酶生物合成

68、的模式,根據細胞生長和產酶的關系，酶生物合成的模式分為4種類型，即同步合成型（生長偶聯(lián)型）、延續(xù)合成型（部分生長偶聯(lián)型）、中期合成型（特殊的生長偶聯(lián)型）和滯后合成型（非生長偶聯(lián)型）。,85,四、酶發(fā)酵動力學,微生物發(fā)酵產酶,(二)酶生物合成的模式,學習要求,（1）會繪酶生物合成的模式圖。,（2）看圖能判斷是哪一種模式。,（3）看圖能說出有關特點。,（4）影響產酶模式的主要因素是什么？,,（5）每一種產酶模式是不是固定不變的？如果不是，哪