利用纖維素產(chǎn)丁醇微生物的發(fā)酵工藝及基因工程改造.pdf

1、生物能源作為一種可再生能源，能夠有效地解決能源危機、環(huán)境污染和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展等諸多問題。丁醇包括正丁醇和異丁醇，因其較高的能量密度、在運輸與儲存方式上的安全性與便利性、與乙醇相比的低吸濕性和低腐蝕性、與汽油相近的理化特性以及其作為化工原料的廣泛應(yīng)用前景，得到了世界各國的廣泛關(guān)注與重視?，F(xiàn)階段生物發(fā)酵丁醇生產(chǎn)中面臨的主要問題是發(fā)酵生產(chǎn)成本居高不下，利用豐富的、廉價的可再生的纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)丁醇是當前的研究熱點。本研究針對目前制約纖維原料

2、生物轉(zhuǎn)化正/異丁醇研究中纖維素酶成本高，轉(zhuǎn)化效率低的主要技術(shù)瓶頸，考察了粗酶液水解秸稈發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的效能以及利用微生物的協(xié)同作用構(gòu)建了纖維素直接生物轉(zhuǎn)化正丁醇的共培養(yǎng)體系，同時結(jié)合合成生物學(xué)的指導(dǎo)思想，構(gòu)建了纖維素直接生物轉(zhuǎn)化異丁醇的基因工程菌，并對其穩(wěn)定性及效能進行了分析，論文取得主要研究成果如下：
　　針對纖維素糖化發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇過程中纖維素酶的高成本、低活性問題，采用綠色木霉（Trichoderma viride）的胞外粗酶

3、液進行纖維素基質(zhì)的酶解糖化。通過中心組合響應(yīng)面法優(yōu)化粗酶液水解纖維素條件，在pH5.1、水解溫度50.7℃、纖維素酶添加量41.1 U/g、底物濃度38.1 g/L條件下，粗酶水解液中還原糖含量為17.32 g/L，糖化率為62.42％，其糖化效率達到了商品酶R10的82.3%。利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicium）ATCC824對粗酶水解液進行發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇，研究表明在分步糖化發(fā)酵工藝中正丁醇產(chǎn)量，

4、產(chǎn)率和生產(chǎn)速率分別為7.05 g/L、0.155 g/g底物和0.141 g/L·h；在同步糖化發(fā)酵工藝中正丁醇終濃度為5.05 g/L，產(chǎn)率和生產(chǎn)速率分別為0.127 g/g底物與0.080 g/L·h。該結(jié)果證實低成本的纖維素酶粗酶液替代商品酶進行高效纖維素水解糖化及正丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)具有可行性，為纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化正丁醇發(fā)酵生產(chǎn)過程的成本降低提供了一個新思路。
　　根據(jù)微生物間的協(xié)同效應(yīng)的原理，并結(jié)合現(xiàn)有共培養(yǎng)體系研究中各組分菌株

5、生長及作用條件不匹配問題，分別選用本實驗室前期富集篩選得到的中溫厭氧纖維素降解菌系N3和速生梭菌（Clostridium celevecrescens）N3-2，建立了復(fù)合菌系N3和速生梭菌（C. celevecrescens）N3-2與產(chǎn)正丁醇菌株丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicium） ATCC824的共培養(yǎng)體系。在37℃中溫培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)體系N3+ ATCC824和N3-2+ ATCC824降解纖維素產(chǎn)正丁醇能力分別

6、為3.73 g/L和2.69 g/L，正丁醇產(chǎn)率分別為0.145 g/g底物和0.134 g/g底物。該研究結(jié)果為在中溫厭氧條件下實現(xiàn)纖維素直接生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)正丁醇提供重要的理論依據(jù)和參考價值。
　　針對目前尚未發(fā)現(xiàn)有原始菌株可以直接合成異丁醇以及現(xiàn)有異丁醇基因工程菌株無法利用纖維素基質(zhì)直接轉(zhuǎn)化異丁醇的研究現(xiàn)狀，構(gòu)建了一株能夠高效降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的工程菌株。首先通過纖維素降解菌株的篩選，得到一株能夠高效降解纖維素的蠟樣芽孢桿

7、菌（Bacillus cereus）W12。異丁醇耐受性分析發(fā)現(xiàn)W12菌株較其他常見基因工程宿主菌株具有更高的異丁醇耐受能力。在此基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5，將aro10與adh2兩個基因轉(zhuǎn)入W12菌株中得到工程菌株W12-RD，發(fā)酵試驗檢測其異丁醇產(chǎn)量為0.126 g/L，初步實現(xiàn)了利用Ehrlich途徑合成異丁醇的能力。研究發(fā)現(xiàn)不同的基因連接順序會影響特定基因的相對表達量，進而影響了異丁醇產(chǎn)量。通過在發(fā)酵體系中添

8、加不同的Ehrlich途徑前體物質(zhì)，W12-RD菌株能夠合成對應(yīng)的醇類，驗證了該方法的普適性，同時研究發(fā)現(xiàn)Ehrlich途徑的合成具有競爭性。
　　為了進一步提高異丁醇的產(chǎn)量，我們對異丁醇合成前體2-酮異戊酸合成關(guān)鍵基因alsS進行過表達，并敲除pta與pflB基因，以阻斷丙酮酸旁路消耗。得到工程菌株 W12-C2B，采用聯(lián)合生物加工工藝進行纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化異丁醇的一步法發(fā)酵生產(chǎn)，最終異丁醇產(chǎn)量為1.310 g/L、異丁醇產(chǎn)率及最高