反轉(zhuǎn)錄

1、反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄簡(jiǎn)單點(diǎn)說就是從RNA生成CDNA的過程。所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)具有若干種酶活性的多肽亞基這些活性包括依賴于RNA的DNA合成依賴于DNA的DNA合成以及對(duì)D

2、NA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個(gè)多肽亞基兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱且對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長(zhǎng)的cDNA(如大于23kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時(shí)的最適pH值最適鹽濃度和最適溫室各不相同所以合成第一鏈時(shí)相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都

3、必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3端poly(A)結(jié)合的1218核苷酸長(zhǎng)的oligo(dT)。cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:(1)自身引導(dǎo)法合成的單鏈cDNA3端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物當(dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈最后用對(duì)單鏈特異性的

4、S1核酸酶消化該環(huán)即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5端序列出現(xiàn)缺失和重排因而該方法目前很少使用。(2)置換合成法該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性而是在dNTP存在下利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物使之成為合成第二鏈的引物在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個(gè)主要優(yōu)

5、點(diǎn):(1)非常有效(2)直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物無須進(jìn)一步處理和純化(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄簡(jiǎn)單點(diǎn)說就是從RNA生成CDNA的過程。所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分

6、離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)具有若干種酶活性的多肽亞基這些活性包括依賴于RNA的DNA合成依賴于DNA的DNA合成以及對(duì)DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個(gè)多肽亞基兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱且對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長(zhǎng)的cDNA(如大于23kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和

7、MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時(shí)的最適pH值最適鹽濃度和最適溫室各不相同所以合成第一鏈時(shí)相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3端poly(A)結(jié)合的1218核苷酸長(zhǎng)的oligo(dT)。cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:(1)自身引導(dǎo)法合成的單鏈cDNA3端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)這就為第二鏈的合成

8、提供了現(xiàn)成的引物當(dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈最后用對(duì)單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán)即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5端序列出現(xiàn)缺失和重排因而該方法目前很少使用。(2)置換合成法該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性而是在dNTP存在下利用RN