假單胞菌菌株HF-1的尼古丁代謝途徑及其分子生物學(xué)研究.pdf

1、本文以從堆放煙草廢棄物30多年的尼古丁污染土壤中篩選獲得的尼古丁高效降解菌株P(guān)seudomonas sp.HF-1為研究材料，綜合運(yùn)用傳統(tǒng)及現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，全面探討了尼古丁對(duì)典型土壤微生物的氧化應(yīng)激效應(yīng)，篩選獲得缺失尼古丁降解功能的突變菌株，并較為系統(tǒng)地研究了菌株HF-1降解尼古丁的代謝途徑及降解功能酶，為建立有效的尼古丁污染預(yù)警指標(biāo)體系及該降解菌在尼古丁污染生物修復(fù)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)和參考基礎(chǔ)。本研究所獲得的主要結(jié)果如下：

2、 1．以大腸桿菌(Escherichia coli)K12、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B19等土壤典型微生物及尼古丁降解菌假單胞菌(Pseudomonas sp.)HF-1為實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)土壤典型微生物和尼古丁降解菌的生長、活性、應(yīng)激反應(yīng)以及生化指標(biāo)方面的影響，研究了尼古丁對(duì)微生物純培養(yǎng)的生理毒性，獲得如下初步結(jié)論：在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同濃度尼古丁對(duì)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期假單胞菌HF-1的SOD、CATT和ATP酶

3、活性的影響具有顯著差異。不同濃度尼古丁對(duì)穩(wěn)定生長期HF-1菌體的SOD和CAT活性影響較小，且一般表現(xiàn)為抑制作用。1.3g·L<'-1>尼古丁刺激對(duì)數(shù)生長期HF-1菌株ATPase比活力增加，而其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度(0.5 g·L<'-1>，1.0 g·L<'-1>，2.0 g·L<'-1>)都使菌株的ATPaSe比活力下降。尼古丁對(duì)穩(wěn)定期的HF-1菌株ATPase比活力呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)出顯著的濃度-

4、效應(yīng)關(guān)系。尼古丁對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌株的SOD、CAT酶活性均有不同程度的誘導(dǎo)作用，但對(duì)尼古丁降解菌株HF一1的誘導(dǎo)作用弱于其他2種非尼古丁降解菌株。將微生物體內(nèi)SOD、CAT和ATPase酶活性作為環(huán)境受到尼古丁污染脅迫的分子指標(biāo)具有一定可行性。 2．從經(jīng)絲裂霉素C反復(fù)處理的HF-1菌株中篩選獲得1株缺失尼古丁降解功能的突變菌株6-13。突變菌株6-13與出發(fā)菌株HF-1在菌落形態(tài)及菌體形狀上都極為相似，2個(gè)菌株的SDS-PAGE全細(xì)

5、胞蛋白質(zhì)電泳圖譜也基本相同。經(jīng)Blast比對(duì)，突變菌株6-13與Pudomonasputida 16S rDNA的序列同源性達(dá)到100％，基本上可以確定菌株6-13為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)?？股孛舾行栽囼?yàn)表明尼古丁降解菌株HF-1及突變菌株6-13對(duì)于胺卡那霉素、頭孢菌素、硫酸慶大霉素等抗生素敏感，而對(duì)氯霉素、氨芐青霉素、青霉素鈉、克林霉素、紅霉素及先鋒霉素等抗生素具有抗性。用堿裂解法成功地從降解菌株HF-

6、1及缺失尼古丁降解功能的突變菌株6-13中提取到大小為19kb左右的質(zhì)粒，初步表明這個(gè)質(zhì)?？赡芘c尼古丁降解無關(guān)。 3．尼古丁的微生物降解研究結(jié)果表明，假單胞菌HF-1可在21h內(nèi)降解培養(yǎng)基中99.6％終濃度為1.0 g·L<'-1>的尼古丁，對(duì)數(shù)生長期菌體的生長與尼古丁降解之間存在顯著的相關(guān)性。同時(shí)，培養(yǎng)基pH在菌株生長和尼古丁降解過程中基本保持恒定。菌株HF-1在應(yīng)用微生物技術(shù)處理煙草廢棄物方面具有較強(qiáng)的潛力。 利用G

7、C-MS和LC-MS檢測(cè)HF-1菌株的尼古丁代謝中間產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，假單胞菌HF-1代謝尼古丁的途徑與已知的假單胞菌尼古丁代謝途徑存在明顯差異，而與尼古丁在哺乳動(dòng)物中的代謝過程比較相似。除檢測(cè)到其他假單胞菌中未曾報(bào)到的尼古提林、脫甲基尼古丁、可鐵寧、麥斯明等物質(zhì)外，且沒有發(fā)現(xiàn)其他假單胞菌株的尼古丁代謝產(chǎn)物N-甲基麥斯明，同時(shí)形成一種從未報(bào)道過的、淡綠色的代謝產(chǎn)物。這一切均表明假單胞菌HF-1可能以一條新的代謝途徑進(jìn)行尼古丁降解。利用制備型液相

8、色譜分離得到4種尼古丁代謝產(chǎn)物，分離峰保留時(shí)間分別為3.6-5.0，5.6-6.7，7.5-8.4和10.2-10.9 min。后3個(gè)樣品在負(fù)離子模式下進(jìn)行ESI-MS分析，測(cè)得3種物質(zhì)的分子量分別為179Da、195Da和487Da，其中分子量為179Da和195Da的代謝產(chǎn)物初步鑒定為3-琥珀酰吡啶和6-羥基-3-琥珀酰吡啶。這2種尼古丁代謝中間產(chǎn)物的存在表明自3-琥珀酰吡啶開始菌株HF-1降解尼古丁的途徑與已知假單胞菌的尼古丁代謝

9、途徑相似。6-羥基-3-琥珀酰吡啶在Pseudomonas sp．HF-1中的去向尚有待于進(jìn)一步研究。 4．利用雙向電泳及生物質(zhì)譜技術(shù)研究了尼古丁誘導(dǎo)條件下菌株HF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，并對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的特異性蛋白進(jìn)行了鑒定。研究表明，菌株HF-1在尼古丁脅迫條件下新誘導(dǎo)合成65個(gè)特異性蛋白。實(shí)驗(yàn)切取22個(gè)特異性蛋白質(zhì)點(diǎn)，利用：MALDI-TOF/TOF-MS和ESI-MS進(jìn)行了蛋白質(zhì)的鑒定。根據(jù)蛋白質(zhì)某一方面的主要功能，可以將尼

10、古丁誘導(dǎo)表達(dá)的22個(gè)蛋白分為氨基酸合成、能量代謝、蛋白折疊、脫毒和熱激蛋白、尼古丁代謝相關(guān)及其他功能蛋白等5大類。 菌株HF-1誘導(dǎo)表達(dá)了一系列氨基酸合成相關(guān)蛋白(Omithine carbamoyltransferase．Thiolase等)、ATP合成相關(guān)蛋白(Succinate dehydrogenase，Maleate cis-trans isomerase等)、解毒蛋白及運(yùn)輸?shù)鞍?Hsp20 family，Catala

11、se，Superoxide dismutase等)等蛋白來應(yīng)激尼古丁的脅迫，減少尼古丁對(duì)菌體細(xì)胞的傷害。 尼古丁脅迫條件下菌株HF-1誘導(dǎo)表達(dá)了一種內(nèi)酰胺酶(metallo-beta-lactamase)和一種水解酶(hydrolase，an amidase related to nicotinamidase)，這兩種酶的誘導(dǎo)表達(dá)表明菌株HF-1可能沿著與哺乳動(dòng)物代謝尼古丁相同的途徑將尼古丁轉(zhuǎn)化成為3-琥珀酰吡啶(4-OXO-4