發(fā)育生物學(xué)課件

1、發(fā)育生物學(xué),第一章 序 言,一、前言 (一) 概念 發(fā)育生物學(xué)是一門研究生物體從精子和卵子發(fā)生、受精、發(fā)育、生長(zhǎng)到衰老、死亡規(guī)律的科學(xué)。 發(fā)展基礎(chǔ)：胚胎學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)。 發(fā)展過(guò)程：形態(tài) 機(jī)理 組織器官 細(xì)胞 分子,,,,本課程的主要講授內(nèi)容,序言：發(fā)育生物學(xué)中的一些基本原

2、理；發(fā)育生物學(xué)中的動(dòng)物模型；發(fā)育生物學(xué)中的現(xiàn)代技術(shù)。胚胎的早期發(fā)育：卵裂、原腸作用、神經(jīng)胚作用。細(xì)胞分化的機(jī)制：側(cè)重基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)組織器官形成和分化的影響。果蠅軀體輪廓發(fā)育的分子機(jī)制四肢動(dòng)物的肢體的發(fā)育性別決定與生殖細(xì)胞,主要參考書,Scott Gilbert編:《Developmental Biology》，6th Editions, 2000.Lewis Wolpert主編：《 Principles of Develo

3、pment》，1998.Klaus Kalthoff:《Analysis of Biological Development》，2nd edition, 2001.Bruce M. Carlson: 《Human Embryology & Developmental Biology》, 2nd Edition,1999.,發(fā)育生物學(xué)相關(guān)期刊,(二)、發(fā)展歷史1、后成論(epigenesis)和先成論(preformatio

4、n)之爭(zhēng) 希臘哲學(xué)家Aristotle在公元前第4世紀(jì)在對(duì)雞胚和一些無(wú)脊椎動(dòng)物胚胎觀察后提出胚胎發(fā)育的兩種假設(shè)： Preformation:生物個(gè)體的一切組成部分都早就存在于胚胎中，各個(gè)部分隨著胚胎的發(fā)育而長(zhǎng)大。Epigenesis: 在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，各種結(jié)構(gòu)是逐漸形成的。,17世紀(jì)，意大利胚胎學(xué)家 Marcello Malpighi觀察到的雞胚,17世紀(jì)，精原學(xué)說(shuō)的代表人物Nicholas Hartsoeker

5、所想像的精子中的微型人法國(guó)科學(xué)家Bonnet(1745)提出胚胎發(fā)育套裝論,19世紀(jì)30年代末：Mathias Schleiden和Theodor Schwann提出細(xì)胞學(xué)說(shuō)。1840, August Weismann提出了生殖細(xì)胞論，認(rèn)為后代個(gè)體是通過(guò)精子和卵子繼承親本描述軀體特征的信息；卵子是一個(gè)細(xì)胞，其分裂產(chǎn)生的細(xì)胞可分化出不同組織，從而否定了preformation論。19世紀(jì)對(duì)Sea Urchin受精卵的觀察發(fā)現(xiàn)，受精

6、卵含有兩個(gè)細(xì)胞核，并最終合并為一個(gè)細(xì)胞核，表明細(xì)胞核含有遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。19世紀(jì)末，染色體的發(fā)現(xiàn)和發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目在發(fā)育中的變化規(guī)律，使孟德?tīng)栠z傳定律有了物質(zhì)基礎(chǔ)。,2、細(xì)胞學(xué)說(shuō)改變了胚胎發(fā)育和遺傳的概念,3、Mosaic and Regulative Development 19世紀(jì)80年代，Weismann提出了mosaic development學(xué)說(shuō)：合子中的大量特殊因子在細(xì)胞分裂中不均等分配，導(dǎo)致了不同細(xì)胞向不同命

7、運(yùn)的發(fā)育。,3、Mosaic and Regulative Development(續(xù)) 支持嵌合體學(xué)說(shuō)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：Wilhelm Roux的實(shí)驗(yàn)：,3、Mosaic and Regulative Development(續(xù)) Wilhelm Roux的同事Hans Driesch的下述實(shí)驗(yàn)表明，胚胎具有在局部被排除或受損傷后仍正常發(fā)育的能力，即胚胎發(fā)育是可調(diào)節(jié)的。,4、Discovery of Induct

8、ion 1924年，Hans Spemann和Hilde mangold的移植實(shí)驗(yàn)表明，胚胎的一種組織可以指導(dǎo)另一種相鄰組織的發(fā)育。,5、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)與發(fā)育生物學(xué)的結(jié)合,1900年，孟德?tīng)栠z傳定律研究遺傳元素在世代間的傳遞。1909年荷蘭植物學(xué)家Wilhelm Johannsen提出基因型和表現(xiàn)型的概念，首次使遺傳學(xué)和胚胎發(fā)育學(xué)發(fā)生關(guān)系。20世紀(jì)40年代證明：DNA是遺傳物質(zhì)，控制蛋白質(zhì)的合成。20世紀(jì)50

9、年代發(fā)現(xiàn)：DNA為雙螺旋結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)60年代：三聯(lián)體密碼被破解。20世紀(jì)70年代：DNA重組技術(shù)出現(xiàn)。20世紀(jì)80年代：轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)。20世紀(jì)90年代：動(dòng)物克隆技術(shù)出現(xiàn)。世紀(jì)之交：HGP。新的突破：stem cells, proteomics, conditional gene knockout, mutagenesis,二、發(fā)育生物學(xué)研究中的主要模式動(dòng)物 各

10、種模式動(dòng)物各有優(yōu)點(diǎn)，其研究成果不僅可以揭示特定物種的特點(diǎn)，還有助于動(dòng)物發(fā)育的一些普遍規(guī)律和機(jī)制。 (一) Invertebrate Models,主要優(yōu)點(diǎn)1. 體積小，易于繁 殖；2. 產(chǎn)卵力強(qiáng)；3. 性成熟短；4. 易于遺傳操作： 如誘變；5. 基因組序列已全 部測(cè)出 (Science, Mar. 24, 2000)。(120Mb encodes 13,601 proteins),1

11、. Drosophila melanogaster: Insect model,2、Caenorhabditis elegans: Worm model,主要優(yōu)點(diǎn)1. 易于養(yǎng)殖：成蟲 體長(zhǎng)1mm，易冷 凍保存；2. 性成熟短：2.5-3 天，兩種成蟲；3. 細(xì)胞數(shù)量少，譜 系清楚；4. 易于誘變；5. 基因組序列已全部測(cè)出 (Science, Dec. 11, 1998)。(97MB enco

12、des 19,099 proteins.),(二)、Vertebrate Models,1. Xenopus laevis: Amphibian model,主要優(yōu)點(diǎn)1. 性成熟短； 2. 卵體大，易于操 作；3. 抗感染力強(qiáng)，易 于組織移植；,主要優(yōu)點(diǎn)1. 體積小，易于飼 養(yǎng)殖；2. 產(chǎn)卵力強(qiáng)；3. 性成熟短；4. 易于遺傳操作： 如誘變；5. 體外受精和發(fā)育， 易于觀察；6.

13、 基因組序列已全 部測(cè)出。,2. Danio rerio (zebrafish),3. Mus musculus (Mouse),4. Gallus gallus (Chicken),三、發(fā)育生物學(xué)中的基本概念及規(guī)律,(一)、Five major developmental processes1. Cell division: Cleavage: 細(xì)胞分裂快、沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的間歇期，因而新生細(xì)胞的體積比母細(xì)胞小。,2

14、. Pattern formation: (1) 軀體軸線的制定,2. Pattern formation: (2) 胚層的形成,3. Morphogenesis最突出的形態(tài)變化發(fā)生在原腸作用開(kāi)始之后。,4. Cell dif-ferentiation: 人類胚胎可最后發(fā)育出至少250種不同細(xì)胞類型，分化通常是不可逆的。,5. Growth 胚胎在基本的pattern形成之后，其體積會(huì)顯著增長(zhǎng)，原

15、因在于細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞體積增加、胞外物質(zhì)的積累。不同組織器官的生長(zhǎng)速度也各異。,(二)、Cell Behaviour Cell behavior Gene Embryonic development 細(xì)

16、胞行為主要包括：Cell state: 指基因活性狀況。Cell-to-cell signaling: 細(xì)胞間信號(hào)的傳送、接受、反應(yīng)。Cell movement and cell-shape changes:細(xì)胞通過(guò)形態(tài)改變及運(yùn) 動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械動(dòng)力，導(dǎo)致特殊結(jié)構(gòu)的形成。Cell proliferation: 軀體不同部位的細(xì)胞增生速度不一，可導(dǎo)致

17、 整體結(jié)構(gòu)的改變。Cell death: 在特定的發(fā)育時(shí)期，特定部位的細(xì)胞的死亡是形成 正確結(jié)構(gòu)所必需的。,,,,(三)、基因控制細(xì)胞行為 是通過(guò)控制細(xì)胞中的蛋 白質(zhì)的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的,House-keeping proteins:幾乎存在于所有類型細(xì)胞中，通常用于產(chǎn)生能量、在代謝途徑中生成或降解產(chǎn)物，如組蛋白及轉(zhuǎn)錄或翻譯中所必需的蛋白因子。

18、Tissue-specific proteins: 存在于特殊類型細(xì)胞中，從而賦予細(xì)胞特定的活性。如血細(xì)胞中的血紅蛋白－輸氧、肌肉細(xì)胞合成myosin、actin、tropomyosin為收縮提供能量。包括酶、生長(zhǎng)因子、受體蛋白、結(jié)構(gòu)分子。 細(xì)胞可從多個(gè)方面來(lái)控制蛋白質(zhì)的合成。,(四)、發(fā)育是漸進(jìn)式的、細(xì)胞命運(yùn)決定于不同的發(fā)育時(shí)間,Fate of cells:指正常發(fā)育情況下細(xì)胞將發(fā)育的方向，這種方向可因條件

19、的改變而改變(see next slide)。Determination:指細(xì)胞特性發(fā)生了不可逆的改變，發(fā)育潛力已經(jīng)單一化。Specification:指一組細(xì)胞在中性環(huán)境下離體培養(yǎng)，它們?nèi)园雌湔Ｃ\(yùn)圖譜發(fā)育。,兩棲動(dòng)物眼區(qū)細(xì)胞的潛能隨發(fā)育時(shí)期的不同而改變,原腸胚中眼區(qū)將發(fā)育為眼睛。,將原腸胚中眼區(qū)細(xì)胞移植到神經(jīng)胚的軀干區(qū)，它們將按新部位的命運(yùn)發(fā)育為體節(jié)和脊索。,將神經(jīng)胚中眼區(qū)細(xì)胞移植到神經(jīng)胚的軀干區(qū)，它們?nèi)詫l(fā)育為類似于眼的結(jié)構(gòu)

20、。,胚胎發(fā)育早期，細(xì)胞的發(fā)育潛力更大！,(五)、誘導(dǎo)作用可使細(xì)胞互為不同,擴(kuò)散性信號(hào)分子,跨膜蛋白的直接互作,間隙連接(gap junction),信號(hào)傳導(dǎo)特點(diǎn),傳遞距離有限并非所有細(xì)胞都能對(duì)某種信號(hào)發(fā)生反應(yīng)。不同類型細(xì)胞可對(duì)同一信號(hào)發(fā)生不同反應(yīng),e.g., 乙酰膽堿使心肌收縮頻率下降，但促使唾液腺分泌唾液。,Autonomous cell fatenon-autonomous cell fate,(六)、Patterning常涉

21、及positional information的翻譯,,(六)、Patterning常涉及positional information的翻譯(續(xù)),(七)、間距模式(spacing patterns)可通過(guò)側(cè)向抑制作用產(chǎn)生,(八)、胞質(zhì)決定成分的區(qū)域化及細(xì)胞的不對(duì)稱 分裂使細(xì)胞具有不同的特性,,線蟲的不對(duì)稱卵裂產(chǎn)生不同命運(yùn)的卵裂球,二、傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù),染料細(xì)胞標(biāo)記,熒光細(xì)胞標(biāo)記,細(xì) 胞 移 植,三、控制發(fā)

22、育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法,基因組時(shí)代：人類基因組計(jì)劃,DNA序列已經(jīng)告訴了我們什么？,后基因組時(shí)代＝功能基因組時(shí)代,空間結(jié)構(gòu)？,胞內(nèi)分布及靶位？,影響器官？,基因類型？,底物？,影響途徑？,(一)、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。,(一)、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法,從自然或人工

23、突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,隱性突變；半顯性突變；顯性突變,突變體的類型,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,突變類型圖示,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,自然群體中的突變體；化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基－乙脲－乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylur

24、ea ethylnitrosourea, ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等；X－射線或 r－射線照射,獲得突變體的方法,斑馬魚上ENU化學(xué)突變研究的成就(1996),從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,化學(xué)誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,隱性突變體的鑒定方法,化學(xué)誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定,從自然或人

25、工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,Expression of GFP in virus-infected fish,Transient,germline,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,An example of mutational phenotypes,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,Genetic mappin

26、g and chromosomal walking；PCR or Southern hybridization；Candidate cloning；Differential display/subtractive cloning,從突變體克隆基因的方法,(一)、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的

27、基因。,分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法,獲取特定組織：直接取材或轉(zhuǎn)基因法取材；構(gòu)建cDNA文庫(kù)；從蛋白質(zhì)到基因；Differentiatial hybridization/differential display/subtractive cloning,分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法,基因芯片/核酸雜交法,Subtractive cloning,分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法,利用基因序列同源性的克隆法,用一個(gè)物種的基因直接做探針?lè)蛛x另

28、一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)多個(gè)物種的蛋白序列分離另一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)同一基因家族的不同成員間的保守序列分離新的家族成員；,利用大分子間的相互作用克隆新的基因,鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay)克隆靶蛋白的表達(dá)基因。,利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用,分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法,利用蛋白質(zhì)之間的相互作用,酵母雙雜交法,(二)、基因表達(dá)的檢測(cè),mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子

29、活性檢測(cè),(二)、基因表達(dá)的檢測(cè),mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè),mRNA的檢測(cè),Northern blotDot blotRT-PCRDNA Microarrayin situ hybridization,Northern雜交的作用：檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄物的存在及是否發(fā)生了選擇性拼接。,mRNA的檢測(cè),原位雜交(in situ hybridization),利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時(shí)空譜,mRNA的檢測(cè),(二)、

30、基因表達(dá)的檢測(cè),mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè),蛋白質(zhì)的檢測(cè),電泳法Western blot抗體染色法,(二)、基因表達(dá)的檢測(cè),mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè),啟動(dòng)子活性檢測(cè)法,表達(dá)載體的構(gòu)建：,(三)、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)異位表達(dá)法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDs

31、RNA interference (RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,用基因敲除法研究基因的功能,三、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)異位表達(dá)法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oli

32、gosDsRNA interference (RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因的異位表達(dá),DNA注射；RNA注射；病毒感染。,用組織特異性啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá),,綠色血液,,綠色神經(jīng)細(xì)胞,,(三)、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout

33、)異位表達(dá)法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference (RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,(三)、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)異位表達(dá)

34、法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference (RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,Dominant Negative Receptor Mutations,細(xì)胞膜,Dominant