謝寧臨床病原體檢查

1、1,,第九章 臨床常見病原體檢測,川北醫(yī)學院檢驗系謝 寧,2,,概 述,感染性疾病 凡由病原生物包括細菌、真菌、 病毒、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體或寄生蟲侵入人體所致的疾病，統(tǒng)稱為感染性疾病。,3,找到病原菌,感染性疾病,控制更有效?。?！,4,,臨床病原體檢查目的,確定感染的發(fā)生和性質(zhì)。 在疾病早期提供恰當?shù)闹委煼桨?，并采取有效的預　 防措施。 防止感染傳播所造成的危害。 病原體檢查重要性：明確臨床診斷

2、 指導臨床用藥,5,,臨床病原體檢查的基本程序,醫(yī)生、護士、病人、檢驗師：正確規(guī)范采集運送標本。 檢驗科：直接鏡檢、免疫學、分子生物檢測、病原體 分離培養(yǎng)鑒定和藥敏實驗——報告結(jié)果。 醫(yī)生：明確診斷、合理用藥。,,6,,,第一節(jié) 標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法,7,,一、標本采集和運送,無菌操作,采集時間、部位,8,,,檢驗申請單的基本內(nèi)容,The patient,s name an

3、d hospital number. Age and sex. Collection date and time. Diagnosis. Source of the specimen. Ordering physician. Immunization history and antimicrobial therapy. Objective.,9,,（一）血液標本的采集,適應癥 采集時機 皮膚準備 培養(yǎng)瓶消毒

4、 采血量 采血套數(shù) 振搖 室溫送檢,10,,（二）尿標本的采集,晨起第一次尿液為佳沖洗外陰部、尿道口清潔中段尿?qū)驉u骨穿刺采集膀胱內(nèi)尿液不得加防腐劑和消毒劑,11,,（三）糞便標本的采集,自然排便，挑取膿、血或粘液部分于清潔容器中送檢。排便困難者，采用直腸拭子采集。根據(jù)細菌種類不同選用合適的運送培養(yǎng)液以提高陽性檢出率。傳染性腹瀉應連續(xù)送檢3次。,12,,(四) 呼吸道標本的采集,13,,痰標本的采集,采集時間：晨痰

5、，且在取痰 前用清水反復漱口。 方法：（1）自然咳痰法：（2）氣 管鏡下采集法；（3）氣管 穿刺法。,14,要求：≤10個鱗狀上皮細胞/低倍 ≥25個WBC /低倍,15,,（五）腦脊液與其他無菌體液標本,無菌注射器穿刺采集，置于無菌容器中立即送檢。腦脊液標本應立即保溫送檢，不能暫時保存于冰箱中。第一管用于微生物學檢查。胸腹水等體液標本應抽取2-5ml送檢。,16,,（六）泌尿生殖道標本的采集,常取生殖道分

6、泌物男性：無菌采集尿道口分泌物或前列腺液。女性：用無菌棉簽采集陰道或?qū)m頸分泌物。生殖道皰疹常穿刺取皰疹液,17,,（七）膿液及創(chuàng)傷感染分泌物標本,18,,膿液及創(chuàng)傷感染分泌物標本,開放性膿腫及膿性分泌物： 直接涂片染色鏡檢 用NS沖洗表面→兩支無菌棉拭取膿液或深部分泌物 分離培養(yǎng)封閉性膿腫：

7、 滅菌試管→ 一般細菌培養(yǎng) 消毒皮膚粘膜→注射器無菌抽取膿液 厭氧送檢→供厭氧菌培養(yǎng)大面積燒傷的創(chuàng)面分泌物： 無菌棉拭→取多部位創(chuàng)面膿汁分泌物→無菌試管送檢。,,,,,19,,,二、標本的實驗室質(zhì)量評估標準,無標簽的標本或標簽信息與申請單信息不一致；送檢日期延誤的標本；容器有破損或滲漏等；標本儲存、運送方式不當；明顯污染標本；量明顯不

8、足標本；重復送檢標本（血培養(yǎng)除外）烈性傳染病標本的采集和運送不符合相關(guān)規(guī)定,,拒 收,20,,三、檢查方法,直接顯微鏡檢查。病原體抗原與抗體的檢測。病原體核酸的檢測。病原體的分離培養(yǎng)與鑒定。,21,,（一） 直接顯微鏡檢查,不染色標本檢查法：懸滴法和壓滴法染色標本檢查法： 革蘭染色：細菌、真菌 抗酸染色：抗酸桿菌（結(jié)核、麻風） 墨汁染色：隱球菌,22,23,,直接顯微鏡檢查的優(yōu)缺點,優(yōu)點：快速診斷或初步診斷。

9、 缺點：不能準確鑒定細菌真菌的屬和種；未進行藥 敏試驗，不能準確指導臨床抗生素治療。,24,,,（二）病原體抗原檢查,方法：免疫熒光、酶免、化學發(fā)光等。 排除交叉抗原的影響，病原體抗原檢測可明確感染的病原體,HIV抗原檢測實驗原理示意圖,25,,,（三）血清學實驗,特異性 IgM可作為感染性疾病 早期診斷指標，且可區(qū)分原 發(fā)與復發(fā)感染。 特異性 IgG，尤其雙份血清的 滴度呈4倍或4倍以上升高，考

10、 慮病原體感染。,26,,,（四）病原體核酸的檢測,聚合酶鏈反應（PCR）：擴增 病原體微生物特異的DNA或RNA 片段。探針雜交法：通過已知序列的 探針與病原體的核苷酸雜交， 用以了解病原體的有無。主要適用于不能或很難分離培 養(yǎng)的微生物。,27,,（五）病原體的分離培養(yǎng)與鑒定,目的： 明確感染病原體。 為臨床提供體外抗微生物藥物敏感試驗結(jié)果。,28,,細菌、真菌：選擇合適的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法、觀察 菌落性

11、狀、生化鑒定、血清學實驗。病毒、立克次體、衣原體：接種雞胚、易感動物或 進行細胞培養(yǎng)，觀察增殖指標和血清學方法鑒定。,,29,細菌感染檢測程序,30,病實毒驗感室染診性斷疾 病 的,31,,,細菌分離培養(yǎng)與鑒定的結(jié)果評價,培養(yǎng)陰性,培養(yǎng)陽性,32,,,第二節(jié) 病原體耐藥性檢測,33,,,抗生素耐受的起點：盤尼西林,１９２８年 弗萊明 Fleming,１９４０年弗洛里 Florey&錢恩 Chai

12、n,34,,,耐藥性的歷史,1941 青霉素 1960 甲氧苯青霉素1943 鏈霉素 1962 林可霉素1945 頭孢菌素 1962 喹諾酮類1950 四環(huán)素 1970 青霉烯類 1952 紅霉素 1980 單環(huán)β-內(nèi)酰胺類 1956 萬古霉素 2010 抗生素時代的終結(jié)？？？,,超級細菌?。?！,35,,可以預測藥物在病人體內(nèi)的效果，指導臨床合理選擇 抗生素； 了解本地區(qū)或本醫(yī)院內(nèi)常見病原

13、菌的種類及耐藥性， 有助于臨床經(jīng)驗性治療時合理選藥。 定期對病原菌種類和耐藥譜分析，有助于發(fā)現(xiàn)醫(yī)院感 染暴發(fā)或流行。,細菌藥敏檢測的意義,36,,定義：對某種抗菌藥物敏感的細菌變成對該藥物耐受稱 細菌耐藥性。 類型：天然耐藥：是通過染色體DNA突變所致。獲得性耐藥：是由質(zhì)粒介導、轉(zhuǎn)位因子的插入以及其他遺 傳物質(zhì)攜帶外來DNA片段導致產(chǎn)生的耐藥性。,細菌耐藥性,37,,細菌水平和

14、垂直傳播耐藥基因的整合子系統(tǒng)； 產(chǎn)生滅活抗生素的水解酶和鈍化酶； 細菌抗生素作用靶位改變； 細菌膜外排泵出系統(tǒng)； 細菌生物膜的形成。,細菌產(chǎn)生耐藥的常見機制,38,,39,,K-B紙片瓊脂擴散法 稀釋法： E試驗MIC （最低抑菌濃度）,藥敏檢測的方法,40,,藥敏實驗結(jié)果的解釋,根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準判斷：敏感（susceptible，S):表示推薦使用該抗生素進行臨床治療。耐藥(resi

15、stant，R):指常規(guī)用藥劑量不能達到MIC，臨床治療不可靠。中介(intermediate，I):表示藥物MIC接近體液或組織可達到藥物濃度，但反應低于敏感株；但在一些濃集部位（如尿液中的喹諾酮類）或者使用高于正常給藥量時臨床上使用有療效。,41,,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）（2）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)（3）氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌（HLAR）（4）耐萬古霉素腸球菌（VRE）,特殊耐藥菌檢測的臨床意義

16、,42,,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）[MRSA+MRCNS] NCCLS規(guī)定：MRS對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和含酶抑制劑的復方制劑均應報告耐藥，而不考慮體外藥敏結(jié)果，治療首選藥物為萬古霉素。,特殊耐藥菌檢測的臨床意義,43,,44,,（2）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)： 該酶水解青霉素、頭孢菌素及單胺類，主要由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌產(chǎn)生。 NCCLS規(guī)定：產(chǎn)ESBL細菌,不論

17、體外藥物敏感試驗結(jié)果如何, 對青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南治療均無效，建議用碳青酶烯類抗生素。,特殊耐藥菌檢測的臨床意義,45,,46,,（3）氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌（HLAR） NCCLS規(guī)定:HLAR指對高濃度慶大霉素或鏈霉素耐藥，提示與細胞壁活性藥物無協(xié)同作用。,特殊耐藥菌檢測的臨床意義,47,,,48,,（4）耐萬古霉素腸球菌（VRE） VRE臨床上可用藥物很有限，可以對氯霉素（或強力霉素、二甲胺四環(huán)素）和

18、利福平做藥敏實驗。但是對青霉素敏感的VRE可用青霉素和慶大霉素聯(lián)合治療；若對青霉素耐藥而不是HLAR可以用壁霉素+慶大霉素。,特殊耐藥菌檢測的臨床意義,49,,,第三節(jié) 臨床感染常見的病原體檢查,50,,,細菌感染檢查項目的選擇,普通細菌：常采用直接鏡檢、分離培養(yǎng)與鑒定明確病原體。 難培養(yǎng)或培養(yǎng)要求高的細菌：綜合運用免疫學或分子生物 學檢測，如結(jié)核分枝桿菌感染以及幽門螺桿菌感染等。流行病學調(diào)查：病原體抗體檢測，如ASO試驗與Wi

19、dal反應等。,51,,,病毒感染檢查項目的選擇,細胞培養(yǎng)快速復制的病毒：細胞培養(yǎng)。 細胞培養(yǎng)不能快速復制的病毒：目前多檢測病毒抗原、特異性抗體或核酸，如CMV。不能細胞培養(yǎng)的病毒：病毒核酸檢測與病毒特異性抗 體檢測，如HCV、HPV等。,52,,,真菌感染檢查項目的選擇與應用評價,直接顯微鏡檢查：初步明確真菌感染分離培養(yǎng)：明確何種真菌感染真菌抗原檢測：只適合于血清與腦脊液中隱球菌、念珠菌以及莢膜組織胞漿菌等 真菌抗體檢測：

20、深部真菌的檢測,53,,,寄生蟲感染檢查項目的選擇與應用評價,直接顯微鏡檢查：觀察寄生蟲生活史的各階段，是寄生蟲感染的主要診斷依據(jù)。 寄生蟲抗體檢測：輔助診斷。,54,,支原體感染檢查項目的選擇與應用,直接顯微鏡檢查：無價值。 分離培養(yǎng)：陽性可明確診斷。 目前臨床多檢測支原體抗原 與核酸，用于早期快速診斷。,55,,衣原體感染檢查項目的選擇與應用,直接顯微鏡檢查：檢查衣原體 包涵體可提供早期初步診斷。 分離培養(yǎng)：陽性可

21、明確診斷。 目前臨床多檢測衣原體抗原與 核酸，用于早期快速診斷。,56,,螺旋體感染檢查項目的選擇與應用,直接顯微鏡檢查有初步診斷價值。 特異性抗體的檢測為確診依據(jù)。,57,,,第四節(jié) 病毒性肝炎檢測,58,,肝炎病毒標志物檢測,甲型肝炎病毒（HAV） 乙型肝炎病毒（HBV）丙型肝炎病毒（HCV） 丁型肝炎病毒（HDV）戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）輸血傳播病毒（TTV）,59,,1.抗-H

22、AV IgM型Ab陽性：可診斷為急性甲型肝炎。 2.抗-HAV IgG型Ab陽性：表示過去曾受過HAV感染， 但體內(nèi)已無HAV，是一種保護性抗體，可用于甲 肝的流行病學調(diào)查。 （對HAV的檢測還有HAV-RNA，其診斷特異性高， 特別是對早期診斷意義更大。）,一 、HAV抗體檢測,60,二、HBV血清標志物檢測,HBV 特點：又稱Dane顆粒，嗜肝性DNA病毒，分為包膜與核心兩部分：包膜上的蛋白質(zhì)即H

23、BsAg；核心部分含雙鏈DNA、DNA聚合酶（DNAP）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），是病毒復制的主體。,61,,,1、乙肝兩對半檢測（1）HBsAg:表面抗原為HBV的主要外殼蛋白，包括前S1、前S2和S蛋白，具有抗原性，HBsAg陽性表示存在HBV的現(xiàn)癥感染，為HBV感染最早證據(jù)。HBsAg陽性見于急性乙肝潛伏期；發(fā)病后3個月不轉(zhuǎn)陰，則易發(fā)展成慢性乙型肝炎或肝硬化。攜帶者HBsAg也呈陽性。HBsAg本身不具

24、有傳染性，但因其常與HBV同時存在，常作為傳染性標志之一。,62,,,（2）抗-HBs：表面抗體抗-HBs是一種保護性Ab（中和性抗體，能中和HBsAg ），抗-HBs陽性提示機體有一定免疫力。一般在感染后3-6個月才出現(xiàn)，可持續(xù)多年。注射過乙型肝炎疫苗或抗-HBs免疫球蛋白者，抗-HBs可呈現(xiàn)陽性反應。,63,,,（3）HBeAg： e抗原 HBeAg陽性是HBV復制的標志，表明乙型肝炎處 于活動期，提示HBV在體內(nèi)復制，傳

25、染性較強； HBeAg持續(xù)陽性，表明肝細胞損害較重，且可轉(zhuǎn) 為慢性乙型肝炎或肝硬化。如轉(zhuǎn)為陰性，表示病 毒停止復制 。,64,,,（4）抗-HBe： e抗體 乙肝急性期即出現(xiàn)，抗-HBe陽性者易進展為慢性乙 型肝炎；慢性活動性肝炎出現(xiàn)陽性者可進展為肝硬 化；抗-HBe陽性表示大部分乙肝病毒被消除，復制 減少，傳染性減弱，但并非無傳染性，HBeAb不是保 護性抗體（不能抑制HBV增殖）。,65,,,（5）抗

26、-HBc ：核心抗體 抗-HBc 是HBV感染后最早出現(xiàn)的抗體，效價高，持續(xù)時間 長，是HBV感染的標志；有IgG和IgM兩種: 抗-HBc總抗體：抗-HBc總抗體主要反映的是抗 -HBc IgG，其檢出率比HBsAg更敏感，可作為 HBsAg陰性的HBV感染的敏感指標；也可用作乙 型肝炎疫苗和血液制品的安全性鑒定和獻血員 的篩選?？?HBc IgG對機體無保護作用

27、，其陽 性可持續(xù)數(shù)十年甚至終身。,66,,,（6）HBcAg：核心抗原 HBcAg位于Dane顆粒的核心部位，被HBsAg 包裹，血中一般無游離的HBcAg；如果患 者HBcAg陽性，提示病人血清中有感染性的 HBV存在，其含量較多，表示復制活躍，傳 染性強，預后較差。,67,,,HBV五項血清標志物聯(lián)合檢測的臨床意義 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe

28、抗-HBc 臨床意義 + - + - + 急性或慢性乙型肝炎，高傳染性 + - - - + 急、慢性乙肝或慢性HBsAg攜帶者 +

29、 - - + + 急性乙肝趨向恢復或慢性乙肝， 弱 傳 染性 - + - - + 急性HBV感染康復期或有既往感

30、 染 史，目前保持免疫力 - - - + + 乙肝恢復期，弱傳染性 - - - - + 急性HBV感染“窗口期”或既往

31、 感染過乙肝，有流行病學意義 - + - - - 疫苗接種后或HBV感染后康復 - + - + +

32、 急性乙肝康復期，開始產(chǎn)生免疫力 - - - - - 非乙肝感染,,,,,,68,,,2、HBV-DNA定性和定量測定 血清中HBV-DNA的存在是HBV感染最直接，最靈 敏和最特異的檢測指標。 HBV-DNA檢測是評價HBV傳染性的最可靠方法。 HBV-DNA檢測結(jié)果與血清免疫學結(jié)果應綜合評

33、價。 HBV-DNA檢測可用于抗病毒藥物治療乙肝的療效評價。 篩查獻血員，防止乙肝病毒輸血后感染。 監(jiān)測血制品的傳染性、乙肝疫苗的安全性。,69,,,三、HCV標志物檢測 1、HCV抗體測定 抗-HCV為保護性Ab,陽性是診斷HCV感染的重要依據(jù)。 抗-HCV IgM 陽性： 常見于急性HCV感染，是診斷丙肝的早期敏感指標； 是HCV活動的指標。 在慢性HCV感染時，若抗-HCVIgM 陽性，只表示病變

34、 活動，常伴有ALT升高；是判斷HCV傳染性的指標。 抗-HCV IgG 出現(xiàn)晚于抗-HCV IgM， 陽性表明體內(nèi) 有HCV感染，但不能作為HCV感染的早期診斷指標。,70,,,2、HCV-RNA檢測HCV-RNA(+)是HCV感染最直接、最靈敏和最特異的檢測指標。HCV-RNA(+)，提示活動性感染；HCV-RNA(-)、抗-HCV IgG（+）：提示既往感染可能性大。HCV-RNA定量檢測可用于病情判斷、病情預測、監(jiān)

35、測干擾素等藥物的療效、檢測血制品的安全性；HCV-RNA可用于研究丙肝發(fā)病機理和傳播途徑。,71,第五節(jié) 性傳播疾病病原體檢測,性傳播性疾?。╯exually transmitted disease,STD）：是指通過各種性接觸而傳播的侵犯皮膚、性器官及全身多臟器的疾病，簡稱性?。╲enereal disease）。,72,,重要的性病及病原體,性 病 病 原 體

36、 淋病 淋球菌 梅毒 梅毒螺旋體 艾滋病 人類免疫缺陷病毒 非淋球菌尿道炎 溶脲支原體、沙眼衣原體等

37、 生殖器皰疹 單純皰疹病毒 尖銳濕疣 人乳頭瘤病毒,,,,73,,艾滋病（AIDS）病原體檢查項目與應用,直接顯微鏡檢查與分離培養(yǎng)：臨床較少采用。 HIV-RNA檢測：排除假陽性可確診。 HIV抗體檢測：顆粒凝集試驗、ELISA等為過篩實驗， Westerblot確診實驗。,74,

38、,梅毒螺旋體感染檢查項目的選擇與應用,暗視野顯微鏡檢查：有初步診斷價值。梅毒血清學試驗： 非特異性抗體的檢測：過篩試驗。 特異性抗體的檢測：確診試驗。,75,淋病病原體的檢測方法選擇與應用（1）,直接顯微鏡檢查：多形核白細胞內(nèi)見革蘭氏陰性雙球菌，男性泌尿生殖道標本可明確診斷，而女性需結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果分析。,76,,淋病病原體的檢測方法選擇與應用（2）,分離培養(yǎng)；廣泛采用，陽性即可確診。 PCR：可用于早期快速診斷，但假陽性率高

39、。 特異性抗原與抗體檢測：方法尚不成熟。,77,,非淋菌性尿道炎檢測方法選擇與應用,特異性抗體的檢測：意義不大。 分離培養(yǎng)；陽性可確診。 直接顯微鏡檢查：適用于衣原體的檢測。 目前臨床多檢測抗原與核酸，用于早期快速診斷。,78,,單純皰疹病毒,分離培養(yǎng)；陽性可確診。 目前臨床常檢測HSV-DNA與HSV抗原，用 于早期快速診斷。,79,,人乳頭瘤病毒,不能分離培養(yǎng) 目前臨床常檢測HPV-DNA與HPV抗原，用于

40、 早期快速診斷。,80,第六節(jié) 醫(yī)院感染常見病原體檢查,醫(yī)院感染（nosocomial infection）：又稱院內(nèi)感染或醫(yī)院獲得性感染，指患者在入院時不存在，也不處于潛伏期，而在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生的感染，包括醫(yī)院內(nèi)獲得的而在出院后發(fā)病的感染。醫(yī)院感染對象：病人（住院、門診）、醫(yī)院職工、探視人員與陪護人員等。,81,,醫(yī)院感染重大事件,2005年安徽宿州 白內(nèi)障手術(shù)2008年西安交通大學第一附屬醫(yī)院 新生兒科2009年

41、天津薊縣婦幼保健院 新生兒科2009年山西太原 血液透析2009年廣東汕頭 剖腹產(chǎn)手術(shù)……,82,,醫(yī)院感染的高危人群,慢性疾病，如腫瘤、糖尿病以及肝硬化等。 免疫抑制劑及激素的使用者。 化療及放療患者。 手術(shù)及麻醉患者。 使用介入性診斷與治療的患者。 廣譜抗生素使用者。,83,,醫(yī)院感染的感染源,病人、醫(yī)院職工、探視人員、陪護人員。 醫(yī)院環(huán)境、未徹底消毒的醫(yī)療器械、血 液制品等。,84,

42、醫(yī)院感染常見的病原體,細菌為主要病原體。細菌的種類因時、地和人而異。不同臨床類型其感染細菌的構(gòu)成比不同。,85,,常見臨床類型,下呼吸道感染：我國最常見，以銅綠假單胞菌為主。尿路感染：以大腸埃希菌 、變形桿菌為主。手術(shù)切口感染：外源性感染，約占25%。胃腸道感染：腸炎，以真菌為主。血液感染：菌血癥，以大腸埃希菌為主。皮膚和軟組織感染：金葡，溶鏈引起的蜂窩織炎等。,86,,①及時；②無菌操作；③立即送檢，床旁接種；④盡量在

43、抗菌藥物使用前采集標本；⑤盛標本容器須經(jīng)滅菌處理，但不得使用消毒劑；⑥送檢標本應注明來源和檢驗目的，使實驗室能正確選用相應的培養(yǎng)基和適宜的培養(yǎng)環(huán)境，必要時應注明選用何種抗菌藥物； ⑦作定量(或半定量)培養(yǎng)；⑧作藥敏試驗，提倡“分級報告”(即分階段報告涂片鏡檢、初步培養(yǎng)、直接藥敏、初步鑒定、最終鑒定與藥敏結(jié)果)和“限時報告”(涂片報告2小時，普通培養(yǎng)3天)。,標本采集和送檢基本原則,87,醫(yī)院感染檢查內(nèi)容,基本原則與病原體感染類似